研究目的:研究表明,RNA的成熟加工是基因表达的重要组成部分。Pre-m RNA剪接是大多数真核生物基因表达的一个重要阶段,RNA剪接事件也是许多疾病的关键,特别是癌症的病理尤为重要。为了实现对肿瘤疾病的治疗,通过在分子水平上利用pre-m RNA剪接的特异性干扰基因表达,是一种有效可行的治疗策略。近年来,基因在m RNA水平上的表达一直受到传统生化方法的限制。这些方法通常只能在体外检测,不能避免分子特异性效应,也不能实时准确监测pre-m RNA剪接,阻碍了pre-m RNA在活体内的剪接成像研究。所以开发体内可视化pre-m RNA剪接和高通量筛选剪接调节剂的理想分子探针是十分有必要的,这将有益于pre-m RNA异常剪接诱导的人类疾病的治疗。研究方法:在本研究中,我们设计了一种可激活的生物发光报告基因,用于对活体中的pre-m RNA异常剪接进行成像。该报道基因Rluc-SMN是通过将人类生存运动神经元2(SMN2)小基因插入海肾荧光素酶(Rluc)的上游而设计的,因此只有未剪接的m RNA才能翻译出活性荧光素酶蛋白。在此之后,我们使用荧光素酶报告系统的方法来检测外来药物类黄酮(ISO)刺激下,荧光素酶活性对药物剂量和药物作用时间的响应,并对提取的细胞总RNA做出RT-PCR分析,最后,利用生物发光成像技术监测动物体内的pre-m RNA异常剪接。结果:将我们构建的报告基因Rluc-SMN转染细胞后,测得的荧光素酶强度显著低于Rluc-control和Rluc-mutant的荧光素酶强度,这表明我们构建的剪接报告基因可以用于pre-m RNA剪接的监测。然后将不同浓度(0、0.25、0.5、1、2μg/ml)的Rluc-SMN或Rluc-mutant构建体转染到293细胞中,CKK-8测定结果表明剪接报告基因对细胞活力没有影响。首先,在细胞水平上完成外来药物类黄酮(ISO)处理,检测出随药物浓度的增强及药物处理时间的增加,荧光素酶表达水平升高,呈现出药物剂量和时间依赖性,表明构建的剪接报告基因可灵敏监测剪接。其次,RT-PCR分析实验结果与荧光素酶检测结果有着一致的趋势。最后,我们构建的荧光素酶报告基因可以在小动物活体内进行成像,通过对成像结果的分析观察,可以得出在剪接抑制剂处理后,剪接过程受到了抑制。总之,荧光素酶报告基因的成功构建为活体实时监测pre-m RNA异常剪接提供了一种新手段。结论:本研究开发的荧光素酶报告基因Rluc-SMN可以有效地实时监测体内pre-m RNA异常剪接。原则上,该报告基因可潜在地应用于剪接依赖性过程的无创性可视化以及细胞中剪接调节剂的高通量筛选。