论文部分内容阅读
木材是自然界非常重要的可再生生物质，是地球上物质能量循环的重要环节。通过分子育种进行木材材性的改良，需深入了解木材形成过程的关键基因及其调控网络。启动子在基因表达调控中起关键作用，它在很大程度上决定所控基因的表达强度及时空模式。植物基因工程中常用的组成型启动子表达具有持续性，不受外界因素的诱导，在实践中取得了广泛的应用，但导入的基因在不同的发育阶段和组织表达无明显差异且强度大，可能会影响植物正常的生长发育。因此需要寻找一些更有效的诱导型或特异性启动子代替，以期更好地调控基因的表达。 前期实验中利用毛白杨（Populus tomentosa Carr）维管再生实验系统，通过基因芯片分析已经获知大量在毛白杨次生维管再生过程中特异表达的基因，选取了差异表达基因NST3，通过生物信息学的方法，找到同源性较高的基因NAC068。 通过PCR同源克隆的方法，从毛白杨中获得了NCAC068基因5＇侧翼区901bp的片段（pProNAC068），与已发表的毛果杨序列比较发现，两者同源性达到94.67％。在PlantCARE数据库中进行顺式作用调控因子搜索，结果表明该序列具有多个核心启动子元件TATA-box和上游启动子元件CAAT-box的同源序列区，还含有多个顺式作用因子等调控元件。 将该片段置换pBI121载体中的35S启动子，即与报告基因GUS融合，构建了植物表达载体 pProNAC068::GUS，通过农杆菌介导的叶盘法转化银腺杨（Populus alba×P. glandulosa）无性系84K，经PCR检测，获得了5株转基因阳性植株。经过GUS活性检测分析发现，该启动子主要在维管形成层区域表达。以转基因植株茎段为材料，提取其总RNA，通过实时荧光定量PCR分析，从整个茎段的整体角度来分析，其转录水平大概是35S的1/3倍，而pProNAC068所驱动的GUS基因表达的区域占据整个茎段的1/5，从而推测该启动子启动转录的强度与35S相当或者更高。 该启动子的分离，为下一步构建维管组织特异表达载体，从而有目的控制外源基因在维管组织特异表达，进一步研究基因功能及其调控机制有重要意义，同时为实现有目的地改良木材材性提供了手段和依据。