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食欲素A(Orexin A)是近年来发现的—种由下丘脑分泌的神经肽,参与机体生殖、神经内分泌、能量代谢、摄食及内脏等生命活动中。目前已证实外加OrexinA可以影响绵羊卵巢黄体化颗粒细胞分泌孕酮,且这种影响是通过上调细胞内cAMP浓度达到的,但是否经由PKA-CREB信号通路则未见报道,因此本试验应用ELISA、Western blot、免疫荧光、免疫组化的方法对OrexinA影响绵羊卵巢黄体化颗粒细胞分泌孕酮的过程是否经由PKA-CREB信号通路进行研究,以期为Orexin A调节绵羊生殖功能提供理论参考。参照本实验室已经建立的绵羊卵巢颗粒细胞培养体系培养细胞,对细胞进行吉姆萨染色及颗粒细胞特有的卵泡刺激素(FSHR)免疫荧光鉴定;CREB特异性抗体免疫组化染色确定及定位CREB;联合添加卵泡刺激素(FSH)、促黄体素(LH)、雌二醇(E2)使颗粒细胞黄体化,并进行鉴定;黄体化颗粒细胞和外加Orexin A的黄体化颗粒细胞经不同浓度(100 nmol/L、1 μLmol/L、10 μLmol/L)CREB 抑制剂(666-15)(HY-101120)处理后ELISA测定其孕酮分泌量,并设相应对照组,以探究抑制CREB是否会对孕酮分泌造成影响和作用最适浓度;黄体化颗粒细胞分组添加PKA抑制剂(H89)(HY-15979)、666-15、OrexinA 受体激动剂(Orexin Receptor Agonist)(HY-19320)、OrexinA 受体抑制剂(Almorexant)(HY-10895A)处理后ELISA测定其孕酮分泌量,并与对应对照组对比,以探究抑制PKA及OrexinA受体是否会对孕酮分泌造成影响;收集各组细胞蛋白,通过Western blot分析各组中CREB、CREB活性形式p-CREB、孕酮合成关键蛋白StAR表达的变化。结果表明:绵羊卵巢颗粒细胞存在CREB且主要表达于细胞核;添加666-15可使黄体化颗粒细胞分泌孕酮量降低,且666-15浓度为10 μLmol/L时抑制作用显著,外加Orexin A抑制同样显著;添加Orexin A的黄体化颗粒细胞组添加H89孕酮分泌显著降低,添加Orexin Receptor Agonist及Almorexant均对该分组细胞分泌孕酮产生影响;Western blot显示孕酮合成关键蛋白StAR、CREB、p-CREB表达与抑制作用有关,它们的表达也受到Orexin Receptor Agonist及Almorexant影响,结果与ELISA相互印证。说明Orexin A在影响绵羊卵巢黄体化颗粒细胞分泌孕酮的作用中,通过与受体结合经由PKA-CREB信号通路发挥作用。