通过对毕赤酵母中试发酵工艺的改进，建立一种简便可行的重组低出血抗凝蛋白EH（EPR-Hirudin，简称EH）的中试放大发酵工艺，并对经分离纯化得到的EH蛋白进行了质量检定方法、质量标准、初步稳定性实验等方面的研究，主要内容如下：首先通过摇瓶培养，绘测毕赤酵母工程菌的生长曲线。然后根据生长曲线，将对数生长期的菌种经过两级摇瓶培养放大后，直接接种到500L的发酵罐中放大培养，通过发酵液的吸光度值（optical density600nm，OD600）和溶氧值（dissolvedoxygen，DO₂），以及菌体湿重动态监测细菌的生长状态，并用流加甲醇的方法诱导表达目的蛋白。表达上清经超滤、两步离子交换层析纯化获得目的蛋白。用非还原型SDS-PAGE和HPLC检测目的蛋白的纯度；用SDS-PAGE和质谱方法分析目的蛋白的分子量；用Western印迹验证目的蛋白；用凝块法检测目的蛋白的抗凝活性。发酵结束时，上清中蛋白含量达到1.41g/L，经后期分离纯化后，得到约21g的EH蛋白，SDS-PAGE分析可见EH蛋白在还原状态下表观相对分子质量约为13.2kD±1.32kD，质谱分析分子量结果约为7.3kD±0.73kD；经Western印迹检测，检测条带为目的蛋白，能被抗水蛭素抗体特异性结合；用非还原型SDS-PAGE和HPLC检测EH蛋白的纯度，其纯度检测结果均＞95%；凝块法检测EH蛋白，其抗凝比活性为512～1024ATU/mg。从而，成功建立了一条简便可行的EH蛋白中试放大发酵生产工艺。