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高血压病严重威胁着人类的健康,已高居死亡原因的首位。食源性降血压肽通过抑制血压调节系统关键性酶—血管紧张素转化酶(ACE),而起到降血压的作用,具有作用温和、安全性高等优点,成为目前研究热点。从天然蛋白酶解(水解)产物中分离提取降血压肽的方法工艺复杂、产量低,而基因工程法可以克服这些缺点,具有广阔的发展前景。本文研究的目标是通过生物信息学和基因工程手段,采用工程菌发酵技术,大批量制备具有高活性和稳定性的金枪鱼降血压肽Tuna AI (PTHIKWGD)。主要内容为：开发基于生物信息学平台的小肽串联基因设计的计算机软件,用于降血压肽基因的设计并分析其宿主菌环境,研究低成本重组蛋白和多肽的纯化方法,对产品进行安全评估和活性检测,并建立降血压肽快速检测方法。主要研究结果如下：(1)开发了用于小肽串联表达设计的计算机软件《肽表达大师Peptide Expression Master》。以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌,利用该软件对Tuna AI进行串联基因单元设计,选择甲酸作为后续重组多肽串联体释放多肽单体的水解体系。根据设计方案,构建了Tuna AI 4拷贝基因单元,以此基因出发构建了克隆载体pUC-4nTunaAI、表达载体pET-4nTunaAI和工程菌BL21-pET-4nTunaAI (n=1、2、4和8)。工程菌经诱导后,所有拷贝数的基因都能成功表达,表达量随拷贝数的提高而提高,工程菌BL21-pET-32TunaAI的串联基因表达量最高,其重组蛋白Fusion-32TunaAI的量约为细胞总蛋白的45.2%。(2)研究了适合重组蛋白Fusion-32TunaAI纯化的超声辅助尿素清洗方法。与表达载体提供Ni2+亲和层析方法相比,此方法具有更好的纯化效果(回收率提高了32.6%)。同时研究发现33℃、6h诱导条件下制备的重组蛋白包涵体的量只有37℃条件下(460.8 mg/L培养基)的58.2%,所以选择37℃、6h作为诱导条件,以超声辅助尿素清洗法制备的包涵体量为指标,进行培养基及培养条件的优化试验。(3)研究了工程菌在5种常见的培养基中重组蛋白包涵体的表达情况,综合考虑,选择LB培养基作为后续试验所用的培养基。在LB中分别添加10 mM Ca2+、Mg2+、K+和EDTA,只有Mg2+可以促进包涵体的表达。经IPTG诱导的大肠杆菌,添加重组蛋白中8种高含量氨基酸(P、T、H、I、K、W、G和D)后,细胞密度均上升,但其中只有添加高稀缺系数的氨基酸(H和Y),包涵体的量才有极显著提升。对经IPTG诱导的大肠杆菌施加超声处理,频率为24±2 kHz的扫频超声处理1.5 min对促进包涵体形成效果最好。最终优化的培养基为含10mM Mg2+的LB,诱导条件为加入IPTG诱导的同时,加入10 mM的色氨酸(Y),并进行低强度扫频超声处理(功率强度0.095 W/cm3,频率为24±2 kHz,时间为1.5 min),继续在37℃条件下培养6 h,包涵体的量可达766.51±44.24 mg/L培养基。(4)研究了重组多肽的低成本纯化方法以及多肽活性和安全性。单体重组多肽通过甲酸切割从重组蛋白F usion-32TunaAI释放后,依次经透析、离子交换层析和凝胶过滤层析纯化,经液质联用和氨基酸测序确认为Tuna AI,最终产量为351.7 mg Tuna AI/L发酵液(纯度为97%)。研究表明制备的重组多肽Tuna AI具有良好的热稳定性和耐酸碱性。为检测多肽内毒素指标,以Tuna AI的最大浓度(0.4g/kg体重)灌胃小鼠ICR,12h内实验动物没有出现因内毒素的摄入而引起炎症反应。以此剂量连续灌胃小鼠3次,观察7天,结果表明tTuna AI没有明显急性毒副作用,有较好的安全性(LD50>1.2 g/kg)。(5)研究了Tuna AI体内降血压试验及其机理。一次性灌胃后,不同剂量Tuna AI能显著地降低大鼠SHR的血压值,并呈现剂量效应,而tTuna AI对正常大鼠WKyR的血压没有显著性影响。高剂量Tuna AI (2.0 mg/kg体重)灌胃SHR后,降血压效果可以维持10 h,其中灌胃6h后达到最大血压降幅(36.5 mmHg),灌胃8和10h后的降血压效果强于captopril对照。测定一次性灌胃6h后各组织ACE活性,发现Tuna AI主要抑制了动脉的ACE活性(抑制率为44.1%),对心、肺和血清的ACE酶活没有明显抑制作用,同时测得心脏的SERCA 2a基因转录的mRNA量提升了1.2倍,动脉内皮素的转录mRNA量减少了31.6%,说明给药后,Tuna AI抑制了ACE的活性,使得Ang Ⅱ的含量降低,进一步调控与血压调控有关的SERCA 2a基因和内皮素基因的表达,使得血压下降。连续35天灌胃后,大鼠SHR的血压都有明显下降,在给药第2周血压值就达到平稳的水平,降压最大幅度为41.6 mmHg,同样的Tuna AI对WKyR的血压没有显著性影响。连续灌胃对SHR和WKyR的体重增加量、全血指标和血清中胆固醇、葡萄糖、甘油三酯也没有明显的影响,但大鼠SHR的心肌酶(肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶同工酶(LDH1))分别下降了24.8%和43.0%。说明连续给药TunaAI控制血压后,可一定程度减少因高血压对大鼠心血管造成的损伤。(6)研究建立了一种Tuna AI的ELISA快速检测方法。将半抗原Tuna AI偶联至牛血清白蛋白上,作为免疫原制备了抗血清。抗血清经两种亲和柱纯化,制备较高纯度的多克隆抗体。利用该多克隆抗体,建立Tuna AI间接竞争ELISA的标准竞争曲线,IC50 为 26.34 ng/mL,检测限LOD为0.83 ng/mL,线性范围为1.5～364.5 ng/mL。测定了Tuna AI在牛奶、大豆分离蛋白和胰蛋白胨中的添加回收率,其回收率为82.13%-112.97%,变异系数为1.76%～7.68%,因此该ELISA方法能够有效精确地测定Tuna AI的含量。