背景:TRPC6是经典瞬时受体电位通道家族成员之一,在哺乳动物的脑、心脏、肾脏和肺等多种组织器官中均有表达,并且在血管平滑肌收缩、足细胞信号转导、中枢神经发育和疼痛调节等多种生理过程中发挥重要的作用。TRPC6蛋白作为组成细胞膜Ca²⁺通道的分子基础,其基因变异导致的蛋白异常表达可引起细胞内Ca²⁺信号通路改变,从而导致心肌肥厚、肺动脉收缩、神经元发育异常、肿瘤细胞增殖等多种病理改变,诱发多种疾病。TRPC6作为众多疾病的潜在治疗靶点,其小分子调节剂逐渐成为新药研究的热点之一。然而,由于TRPC家族成员众多,且不同成员间氨基酸序列同源性较高,因此有关TRPC6特异性小分子调节剂的报道并不多见。目的:使用计算机辅助药物设计（computer aided drug design,CADD）的方法从天然小分子化合物库中虚拟筛选可能和TRPC6蛋白结合的小分子化合物;运用分子间相互作用分析技术测定TRPC6蛋白和小分子化合物间的相互作用;建立过表达TRPC6蛋白的工具细胞,通过检测细胞内钙离子浓度(intracellular calcium concentration,[Ca²⁺]_i)变化进一步确定化合物对TRPC6蛋白的具体生物学活性;建立TRPC6参与调控的局灶节段性肾小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis,FSGS）疾病模型,从整体、组织、细胞和分子水平验证化合物在疾病模型中的作用。本研究旨在筛选出能够特异性结合TRPC6蛋白并抑制其功能的小分子化合物,为更多TRPC6调节剂的发现及创新药物的研究提供实验参考。方法:（1）使用蛋白质结构模拟软件MODELLER 8.0对TRPC6蛋白进行同源建模;应用虚拟筛选软件AutoDock Vina和PyRx对“Natural Products”数据库中15万个天然小分子化合物进行分子对接并评分,筛选评分较高,结合较好的化合物。（2）根据结构对筛选得到的化合物进行分类,选择评分高,结构具有代表性的化合物进行微量热泳动（microscale thermophoresis,MST）实验,测定分析TRPC6蛋白和化合物之间的相互作用。（3）构建过表达TRPC6蛋白的工具细胞,通过检测[Ca²⁺]_i的变化确定化合物对TRPC6蛋白的实际生物学活性,并研究其量效关系及半数抑制浓度(IC₅₀),最终确定目标化合物;利用钙离子成像及MST实验分析目标化合物对TRPC6蛋白的特异性;CCK-8法测定目标化合物细胞毒性。（4）通过查阅文献,设计目标化合物的最优合成路线,主要分为以下两个部分。第一部分:以廉价易得的1-甲基吲哚-2-甲酸和β-丙氨酸乙酯盐酸盐作为起始原料,经酰化反应得到丙酸乙酯衍生物。第二部分:将第一部分得到的丙酸乙酯衍生物经过水解反应（LiOH/H₂O）得到目标化合物3-[（1-甲基-1H-吲哚-2-羰基）胺基]丙酸。急性毒性实验测定化合物对小鼠经口给药的最大耐受剂量。（5）8周龄雄性Balb/c小鼠尾静脉注射10 mg/kg阿霉素建立FSGS模型,分不同剂量组每天灌胃给药,持续6周,代谢笼收集动物尿液,考马斯亮蓝法测定尿蛋白水平;苦味酸比色法测定肌酐水平;二乙酰肟法测定血液尿素氮水平;H&E染色评价肾组织形态变化;Masson染色评价肾组织纤维化水平;PAS染色评价肾小球系膜区和基底膜病变情况;免疫荧光染色法检测足细胞损伤蛋白标志物Nephrin和Desmin的表达水平;TUNEL法检测小鼠肾组织细胞凋亡水平。结果:（1）以5IRX（PDB ID）为模版,通过调整待测蛋白序列中主链各个原子的位置,得到了待测蛋白质TRPC6的虚拟空间结构模型;在AutoDock Vina中,将TRPC6转换为PDBQT文件,并设置为受体,得到可能与化合物产生相互作用的8个结合位点;将15万个小分子化合物对接到蛋白受体5IRX,选择评分小于等于-32的化合物,共263个,将其进行结构分类并结合文献已报道的小分子调节剂的结构,购买结合在不同口袋、评分排名靠前且结构具有创新性的17个小分子化合物。（2）MST实验测定17个化合物和TRPC6蛋白的相互作用,结果显示17个化合物中有8个可以和TRPC6蛋白相互结合,分别为:zinc7042（Kd=30.49μM）,zinc0071（Kd=283.62μM）,zinc3571（Kd=29.78μM）,zinc4330（Kd=94.39μM）,zinc7978（Kd=178.87μM）,zinc0737（Kd=11.03μM）,zinc2840（Kd=26.24μM）,zinc6085（Kd=32.11μM）。（3）成功构建HEK293_hTRPC6工具细胞,通过检测[Ca²⁺]_i变化,发现上述8个化合物中的zinc0737、zinc3571和zinc7042均可抑制TRPC6通道开放,减少细胞外Ca²⁺内流,由胞外通过TRPC6通道进入胞内的Ca²⁺的量较正常组分别下降了:34.84%（0.14±0.02 vs.0.22±0.01,P<0.001）,52.94%（0.10±0.01 vs.0.22±0.01,P<0.001）和38.46%（0.14±0.01 vs.0.22±0.01,P<0.001）,通过检测其量效关系进一步确定了3个化合物的IC₅₀分别为6.6μM、24.1 nM和208.3 nM;化合物zinc7978、zinc6085和zinc0071能够激活TRPC6通道,增加胞外Ca²⁺内流,由胞外通过TRPC6通道流入胞内的Ca²⁺的量较正常组分别升高了:71.04%（0.38±0.01 vs.0.22±0.01,P<0.001）,25.34%（0.28±0.01 vs.0.22±0.01,P<0.001）和14.93%（0.25±0.01 vs.0.22±0.01,P<0.05）;化合物zinc2840和zinc4330对TRPC6通道没有表现出显著的生物学活性。通过对比上述3个发挥抑制作用的化合物的结构和IC₅₀发现,化合物zinc3571的IC₅₀最小且结构简单易于合成,因此我们将其确定为最终的目标化合物。我们使用钙库耗竭剂Tg作为工具药,进一步检测了目标化合物对TRPC1/4/5通道功能的影响,结果发现,Tg激活TRPC1/4/5通道后再给予细胞外Ca²⁺,化合物zinc3571预处理过的细胞通过TRPC1/4/5通道流入胞内的Ca²⁺较溶剂对照组相比没有统计学差异;接着,我们使用MST技术进一步检测了目标化合物和TRPC3/6/7蛋白间的相互作用。结果发现,化合物zinc3571与TRPC6蛋白的结合具有高度特异性,其与TRPC6蛋白的亲和强度是TRPC3蛋白的27倍,TRPC7蛋白的35倍。以上结果表明,目标化合物zinc3571对TRPC1/4/5通道功能并无影响且与TRPC3/7蛋白的亲和作用远弱于TRPC6,因此可以说,目标化合物针对TRPC6蛋白特异性良好。研究化合物细胞毒性的CCK-8实验表明,目标化合物zinc3571的给药浓度小于100μM时作用细胞12 h后,细胞存活率较空白组无统计学差异（P>0.05）,表明目标化合物无明显细胞毒性。（4）合成目标化合物4.152 g,并借助1H NMR,13C NMR,MS及IR对化合物进行结构表征,进一步确定目标化合物的结构。急性毒性实验一次性灌胃给药2.0 g/kg目标化合物,连续观察15天,小鼠精神、食欲、排泄均正常,体重15天处于增长趋势,未发现剧烈中毒和死亡现象;（5）成功建立小鼠FSGS疾病模型,不同剂量灌胃给药6周,6周后模型组较正常组体重及肾重分别降低了29.31%（18.72±0.48 g vs.26.48±0.72 g,P<0.001）和31.22%（0.15±0.01g vs.0.22±0.01 g,P<0.001）,目标化合物低、中、高剂量组剂量依赖性地抑制造模导致的体重及肾重的减轻,其中50 mg/kg剂量组体重及肾重较模型组分别升高35.20%（25.31±1.06 g vs.18.72±0.47 g,P<0.01）和44.14%（0.22±0.01 g vs.0.15±0.01 g,P<0.01）;模型组第6周尿蛋白与尿肌酐比值较造模前标准值升高了约1.89倍（P<0.001）,10 mg/kg剂量组,25 mg/kg剂量组和50 mg/kg剂量组第6周尿蛋白与尿肌酐比值较模型组第6周分别降低23.20%（1.54±0.07 vs.2.00±0.07,P<0.001）,40.17%（1.20±0.13 vs.2.00±0.07,P<0.001）和59.05%（0.82±0.05 vs.2.00±0.07,P<0.001）,且50 mg/kg剂量组第6周尿蛋白与尿肌酐比值较造模前标准值无统计学差异（P>0.05）;血液中肌酐和尿素氮含量模型组较正常组分别升高43.34%（175.60±8.10μmol/L vs.132.30±8.01μmol/L,P<0.05）和25.64%（11.82±0.46 mmol/L vs.9.41±0.16 mmol/L,P<0.01）,10 mg/kg剂量组血肌酐浓度较模型组没有显著差异（P>0.05）,尿素氮含量较模型组下降了14.21%（10.14±0.33 mmol/L vs.11.82±0.46mmol/L,P<0.05）,25 mg/kg剂量组血肌酐和尿素氮含量较模型组分别下降了21.36%（138.11±4.40μmol/L vs.175.60±8.10μmol/L,P<0.05）和19.66%（9.50±0.25mmol/L vs.11.82±0.46 mmol/L,P<0.05）,50 mg/kg剂量组分别下降了27.51%（127.32±4.64μmol/L vs.175.60±8.10μmol/L,P<0.01）和19.89%（9.46±0.12 mmol/L vs.11.82±0.46 mmol/L,P<0.01）;肾组织H&E、Masson及PAS病理学染色结果显示,模型组肾小球系膜区出现显著增生,基底膜明显增厚,发生系膜增生病变（epithelial hyperplasia lesions,EPHL）肾小球的比例高达65.33%,50 mg/kg剂量组较模型组EPHL比例降低了61.73%（25.00±3.22 vs.65.33±9.74,P<0.05）,同时模型组肾小球出现显著纤维化,模型组肾小球纤维化面积较正常组升高了5.75倍（38.53±5.71 vs.5.71±1.42,P<0.01）,25 mg/kg剂量组肾小球纤维化面积较模型组降低了67.69%（12.45±3.68 vs.38.53±5.71,P<0.05）,50 mg/kg剂量组较模型组降低了87.39%（4.86±1.49 vs.38.53±5.71,P<0.01）;Nephrin和Desmin蛋白表达的免疫荧光染色结果显示,模型组Nephrin表达较正常组下调了68.94%（P<0.05）,50 mg/kg剂量组Nephrin表达较模型组增加了1.59倍（0.84±0.10 vs.0.31±0.09,P<0.05）。在不同组别间Desmin表达趋势和Nephrin相反,模型组中Desmin表达较正常组增加了1.20倍（P<0.05）,10 mg/kg剂量组和25 mg/kg剂量组较模型组无统计学差异（P>0.05）,50 mg/kg剂量组较模型组下降了49.32%（1.11±0.17 vs.2.20±0.30,P<0.05）;小鼠肾组织冰冻切片TUNEL染色结果显示,模型组小鼠肾组织中有大量细胞凋亡,25 mg/kg剂量组凋亡细胞较模型组减少了45.60%（1.53±0.30 vs.2.81±0.27,P<0.05）,50 mg/kg剂量组较模型组减少了83.26%（0.47±0.14 vs.2.81±0.27,P<0.01）。结论:化合物zinc3571能够特异性结合TRPC6蛋白;抑制TRPC6介导的Ca2⁺内流;能够显著改善TRPC6参与调控的FSGS模型小鼠的肾脏功能,减缓疾病的发生发展;同时具有结构简单、易于合成、毒性较低的特点,可作为TRPC6理想的小分子抑制剂。