论文部分内容阅读
Alpha钙／钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(alpha calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, αCaMKⅡ)是一种重要的多功能丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,已有大量研究表明其在海马相关学习记忆和突触可塑性中发挥重要的作用。纹状体作为大脑中一个重要脑区,参与运动技巧性学习、刺激—反应联合性学习等功能的调节,并且富含αCaMKⅡ。因此,了解αCaMKⅡ在纹状体中的作用及机制对于揭示纹状体相关运动认知障碍性疾病的发病机理、寻找治疗方法有着十分重要的意义。然而到目前为止,有关αCaMKⅡ在纹状体脑区相关学习任务中的作用及机制尚未完全阐明。本研究采用RNA干扰技术特异性抑制小鼠背侧纹状体脑区αCaMKⅡ的表达,通过分子生物学、离体电生理学和整体行为学技术,从分子、细胞和整体不同层次,系统研究纹状体脑区αCaMKⅡ在纹状体相关行为学中的作用及机制。主要结果如下：1.αCaMKⅡ shRNA小鼠的构建及鉴定本课题采用注射慢病毒包装的小分子RNA干扰技术,构建了背侧纹状体脑区αCaMKⅡ特异性下调的小鼠。Western blotting结果显示,αCaMKⅡ-shRNA小鼠纹状体中αCaMKⅡ表达量仅为对照组WT-GFP小鼠的13%。2.纹状体αCaMKⅡ下调损害小鼠纹状体相关的学习能力加速模式转棒和水十字迷宫行为学任务结果表明,下调纹状体αCaMKⅡ显著降低小鼠运动技巧学习和刺激—反应(stimulation-response)学习能力。并采用open field、pole test、stepping test和wire suspension等行为学实验,排除了纹状体aCaMKⅡ的下调通过影响基本运动能力、协调性及肌肉力量而损害运动技巧学习的可能性。3.纹状体aCaMKⅡ下调不影响背侧纹状体中央多棘神经元(Medium Spiny Neurons, MSNs)电生理特性和突触前递质释放,但显著降低小鼠背侧纹状体脑区的突触传递及长时程增强电生理实验结果表明,aCaMKII下调对背侧纹状体MSNs的基本电生理特征(包括静息膜电位、膜电阻、放电特征和电流电压曲线)及双脉冲抑制(反映突触前递质释放的参数)没有显著影响；但显著减弱了皮层-背侧纹状体通路的基本突触传递以及长时程增强(Long term potentiation, LTP)的幅度。4.纹状体αCaMKⅡ下调降低突触后膜谷氨酸受体表达及功能突触后膜上的离子型谷氨酸受体主要包括α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor, AMPAR)和N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDAR)。 Western blotting结果显示,下调aCaMKⅡ对纹状体突触后膜上AMPAR含量无影响,但能显著降低AMPAR磷酸化水平及NMDAR的含量。与western blotting结果相一致,离体脑片膜片钳实验结果显示,aCaMKⅡ的下调显著降低了背侧纹状体MSNs AMPAR和NMDAR介导的电流。5.纹状体aCaMKⅡ下调能降低纹状体多巴胺浓度高效液相色谱质谱联用的(LC-MS/MS)方法测定结果显示,在纹状体中下调aCaMKⅡ能显著降低多巴胺含量。综合以上实验结果表明,下调aCaMKⅡ能显著损害小鼠背侧纹状体相关的学习能力及皮层—背侧纹状体通路的长时程增强,并且此损害性影响是由于aCaMKⅡ的下调降低了AMPA受体的磷酸化水平、降低了NMDAR的数量和(或)功能以及减少了多巴胺含量所致。