猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS),俗称“蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。该病自1987年首次报道发现于美国以来,现已遍及世界各主要养猪国家与地区,并已成为危害养猪业最严重的传染病之一。我国于1996年首次从国内猪群中分离到PRRSV,从而证实了本病在我国的存在与流行。自2006年6月份以来,在我国南方的湖北、湖南、江西、安徽等省份相继暴发了一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的“猪高热综合症”,至少200多万头猪发病,40多万头猪死亡,给我国的养猪业造成了极为严重的经济损失,引起了社会的广泛关注。通过国内学者的大量研究,证实高致病性PRRSV变异株是“猪高热综合症”的主要病原。而正链RNA病毒的反向遗传操作系统在病毒复制、致病机制研究,抗病毒药物筛选和新型疫苗、导向载体制备等方面是一个极其有用的工具。基于此,本研究开展了PRRSV Clone20株的全基因组克隆与测序、遗传进化分析、感染性克隆及其复制子载体的研究。主要研究内容和结果如下:1.猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Clone20株全基因组克隆、序列测定及遗传进化分析以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Clone20株为材料,参考GeneBank PRRSV VR2332株(AY150564)全基因序列,我们分四段设计引物,通过RT-PCR扩增了PRRSV Clone20株全基因组,将所得的cDNA克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。测序结果表明:覆盖全基因组cDNA重叠片段A、B、C和D大小依次为3920bp、5715bp、3783bp和3323bp,测序结果经分析正确后,利用DNASTAR软件将4个片段拼接成完整基因组序列,获得全基因组核苷酸序列为15412bp(不含poly(A)尾);该序列已经递交给GenBank,序列登录号为:FJ899592。遗传进化树分析表明,我国流行的毒株可以分为2个亚群:以CH-1a为代表的包括JXA1,HUN4等高致病性变异毒株在内的属于亚群1;以VR2332为代表的包含少量国内分离毒株属于亚群2。而本研究的Clone20株属于美洲型,在系统发生树上Clone20与CC-1、MLV和BJ-4株位于同一小分支,与美洲型参考株(VR-2332株)同属于亚群2。同时利用ClustalX2软件对25株PRRSV全序列同源性分析后,进一步用Simplot软件对可能产生重组的序列进行相似性分析和BOOTSCAN分析;结果显示,我国的PRRSV HB-1株为CH-1a与JX143的重组病毒株,确定了重组区域为12665-14105,证实了重组在PRRSV进化过程起着非常重要的作用。2.猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Clone20株感染性克隆的构建本研究使用高保真DNA聚合酶进行基因扩增,每个片段的阳性克隆送3个进行测序,并将测序结果同GenBank中收录的序列进行比较,尽可能地减少PCR引入的突变,获得了较为可靠的基因组cDNA序列。将4个基因片段A、B、C、D依次克隆到低拷贝质粒pOK-12中,同时在全基因组5’端引入CMV启动子序列,在3’端poly(A)后分别引入核酶HDV序列和BGH终止序列,最终获得该毒株的全长cDNA克隆pOK-Clone20。将质粒pOK-Clone20用质脂体转染BHK-21细胞,转染后24小时上清接种Marc-145细胞,连续培养3代,传至第三代出现明显的细胞病变,经RT-PCR扩增sgmRNA7,大小和测序同预期相符,证实获得了有感染性的恢复病毒,表明成功的构建出了具有感染性的PRRSV全长cDNA克隆。为以后在cDNA水平上研究PRRSV的病毒复制、致病机制研究,抗病毒药物筛选和新型疫苗、导向载体制备等方面提供技术平台。3.猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制子载体的研究为构建含有报告基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒亚基因组复制子系统,我们首先在构建感染性克隆策略的基础上,利用PCR方法对C片段和D片段上的含ORF2-ORF6的基因进行缺失,在结构基因中保留与猪繁殖与呼吸综合征病毒复制想关的N蛋白序列、上游含TRS7的序列及下游的3’端非编码顺式激活序列,同时利用PCR的方法引入报告基因EGFP,另外,像构建感染性克隆一样,在复制子5’端引入CMV启动子序列,在3’端poly(A)后分别引入核酶HDV序列和BGH终止序列,然后按感染性克隆构建策略依次把各个片段克隆到低拷贝质粒pOK-12中,最终获得含报告基因EGFP的复制子系统质粒pOK-Clone20-rep。将质粒pOK-Clone20-rep用质脂体转染BHK-21细胞,通过观察EGFP荧光、流式分析和RT-PCR,稳定性试验等方法对复制子进行鉴定。结果显示,pOK-Clone20-rep在在BHK-21细胞中均可稳定表达EGFP,可以在BHK-21细胞中检测到N sgmRNA和EGFP sgmRNA,流式分析显示在pOK-Clone20-rep转染的BHK-21细胞中有9.64%的细胞发出荧光,结果表明,PRRSV复制子在BHK-21细胞中能够正常表达和自我复制。本研究所购建的含有报告基因的PRRSV亚基因组复制子系统在BHK-21细胞中均获得了稳定表达,复制子的成功构建为其进一步发展成疫苗载体、为研究病毒复制、致病机制研究及抗病毒药物筛选奠定了基础。为了进一步探讨PRRSV复制子作为疫苗载体的可能性,以小鼠为模型动物,将复制子载体pOK-Clone20-rep以不同剂量(100μg和10μg )免疫小鼠,试验结果表明,无论体液免疫还是细胞免疫,复制子载体都能较高的体液免疫水平和细胞免疫水平,具有较好的免疫效果。同时复制子也能够激发对N蛋白的体液免疫,表明PRRSV复制子载体可以作为新型的多基因表达的候选疫苗载体。