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猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCo V）属于套式病毒目冠状病毒科δ冠状病毒属,是一种新发的猪源冠状病毒,主要感染新生仔猪,造成仔猪腹泻、呕吐、脱水甚至死亡。临床上经常与猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）和猪轮状病毒（Porcine rotavirus,PRo V）等其他腹泻相关病毒混合感染。自2014年PDCo V在美国首次爆发后,迅速传播至全球各国,给全球养猪业造成巨大的经济损失。冠状病毒除了编码结构蛋白和参与基因组转录、复制的非结构蛋白外,还编码一系列特有的辅助蛋白。目前的研究表明大部分辅助蛋白对于病毒复制是非必需的,但可能影响病毒的致病性。PDCo V作为唯一在体外成功分离的δ冠状病毒,已经被鉴定编码三种辅助蛋白NS6、NS7和NS7a,现有研究表明这三种辅助蛋白参与宿主天然免疫反应的调节,但其对病毒复制及致病性的影响尚不明确。鉴于此,本研究成功分离了PDCo V流行毒株CHN-HG-2017,建立了全球第一个PDCo V的反向遗传操作系统,首次揭示了PDCo V的辅助蛋白在病毒复制及致病性中的作用。主要内容如下:1.PDCo V CHN-HG-2017株的分离鉴定,全基因组序列分析及其致病性研究从RT-PCR检测为阳性的腹泻仔猪粪便中成功分离到一株PDCo V,命名为CHNHG-2017,采用间接免疫荧光和透射电镜对分离的病毒进行了鉴定。通过核苷酸序列比对分析,发现CHN-HG-2017的全基因组与其他PDCo V毒株的全基因组同源性为97.6%-99.1%。使用基因重组分析软件RDP4对CHN-HG-2017的全基因组序列进行分析,发现CHN-HG-2017可能是中国毒株CH/SXD1/2015和越南毒株Vietnam/Ha Noi6/2015的重组毒株。动物试验证实PDCo V CHN-HG-2017株对5日龄仔猪具有较强致病性,在接种后1-7天,仔猪出现腹泻、呕吐、厌食和嗜睡等典型症状。荧光定量PCR检测发现感染仔猪的粪便排毒一直持续到接种后14天。病毒中和试验结果显示感染仔猪在接种后第4天即产生中和抗体且以逐渐升高的趋势持续到接种后21天。2.成功建立了PDCo V CHN-HG-2017株的反向遗传操作系统将PDCo V CHN-HG-2017株全长基因组划分为六个连续的片段,通过体外连接获取病毒全长c DNA,体外转录后将全长转录本电转至LLC-PK1细胞成功拯救PDCo V。将拯救病毒r PDCo V和野生型PDCo V进行对比分析,发现两者的全基因组序列除了分子标记外完全相同,在LLC-PK1细胞上可产生相同的细胞病变,病毒蛋白的表达水平相当;对拯救病毒r PDCo V的生物学特性进行研究,发现其与野生型PDCo V在LLC-PK1细胞上产生的噬斑大小相似,并且在LLC-PK1和IPI-2I细胞中生长动力学相似,表明我们成功建立了PDCo V反向遗传操作系统,为研究病毒编码蛋白在病毒复制和致病中的作用奠定了基础。3.揭示了PDCo V辅助蛋白在病毒复制及致病性中的作用利用建立的PDCo V反向遗传操作系统成功拯救了缺失NS6、NS7基因的重组PDCo V,PDCo V缺失NS6或NS7后在体外仍然可以复制,表明NS6和NS7对PDCo V的复制都不是必需的。在对重组病毒的生物学特性进行研究时发现,尽管缺失NS7的重组病毒r PDCo V-△NS7在体外表现出与亲本病毒相似的生长动力学,但缺失NS6的重组病毒r PDCo V-△NS6-GFP的复制效率明显降低,表明PDCo V辅助蛋白NS6可能在促进病毒复制中起关键作用。同时,动物致病性试验表明接种r PDCo V-△NS7或野生型PDCo V的仔猪表现出相似的腹泻评分和病理损伤。然而r PDCo V-△NS6-GFP感染的仔猪没有表现出任何临床症状,表明NS6蛋白是PDCo V的重要毒力因子,因此NS6缺失的PDCo V可作为潜在的减毒活疫苗候选毒株。此外,我们设计了一种高效表达绿色荧光蛋白的重组PDCo V,可作为高通量药物筛选和中和抗体检测的工具。4.探索了PDCo V辅助蛋白NS6影响病毒复制及致病性的机理为了进一步分析PDCo V辅助蛋白NS6影响病毒复制及致病性的作用机制,将PDCo V NS6与其他结构蛋白及辅助蛋白NS7、NS7a共转染至HEK-293T细胞,免疫共沉淀结果显示PDCo V辅助蛋白NS6与辅助蛋白NS7及NS7a具有相互作用。通过反向遗传操作系统成功将Flag标签插入到病毒辅助蛋白NS6的C端,获得表达NS6-Flag的PDCo V重组病毒。将重组病毒感染LLC-PK1细胞后,通过免疫共沉淀和质谱分析鉴定出了126种可能与辅助蛋白NS6互作的宿主蛋白。对筛选的蛋白进行GO注释发现大部分蛋白均为细胞骨架蛋白,推测辅助蛋白NS6可能通过与细胞骨架相关蛋白相互作用调节病毒与宿主细胞的结合及入侵、释放等多个环节进而影响病毒的复制能力和致病性。