腺联病毒(adeno-associated virus,AAV)属于细小病毒科、依赖病毒属成员,其复制需有腺病毒或疱疹病毒等辅助病毒的协助。AAV基因组长度约为4.7kb,其正股和负股单链DNA以等量比例存在病毒子中。作为基因导入载体,AAV具有无致病性、感染分裂及不分裂细胞和外源基因表达稳定等优点,在缺少辅助病毒情况下,AAV-2还能以定点方式整合于人19号染色体的q13.3-qter位点,因此AAV是很有前景的基因治疗载体。禽腺联病毒(avian adeno-associated virus,AAAV)的研究较少,现有的研究资料表明,AAAV具有其它AAV相似的生物学特性和基因结构,提示可作为禽源细胞基因导入载体。本研究在成功分离AAAV基础上,对其全基因组进行了克隆和序列分析,并对病毒蛋白基因进行了克隆和表达,为构建重组AAAV和进开展禽源细胞外源基因表达研究奠定了基础。一、AAAV的分离与鉴定从某健康鸡群采集泄殖腔棉拭样本10份,将无菌处理的粪便滤液与禽腺病毒1型鸡胚致死孤儿病毒(CELO)共接种11日龄SPF鸡胚,收集接种后72～120h死亡鸡胚尿囊液。根据已发表AAAV VR-865株Rep和Cap基因序列设计引物,用PCR对致死鸡胚尿囊液进行检测,结果从1份样品接种的鸡胚尿囊液中扩增到预期大小的Rep和Cap基因片段。将电泳分离的PCR产物切胶回收,序列测定结果显示与AAAV VR-865株Rep和Cap基因的核苷酸序列同源性分别为97.1%和94.6%。将PCR检测阳性尿囊液进行鸡胚传代,用PCR对不同代次死亡鸡胚尿囊液进行连续检测,结果均能扩增到预期大小的基因片段。从死亡鸡胚尿囊液中纯化病毒,经磷钨酸负染后在电子显微镜下观察,可见典型的AAAV病毒颗粒。用差速和超速离心分离病毒,提取的核酸电泳分析显示预期大小的4.7kb基因组DNA。这些结果表明,从1份健康鸡粪便样品中分离的病毒为AAAV,定名为YZ-1株。二、AAAV全基因组克隆及序列分析根据先前获得的Rep和Cap基因片段序列设计两对引物,分别用PCR扩增约1.9kb的Rep-Cap基因片段以及约2.1kb的Cap-ITR-Rep基因片段,分别克隆入质粒载体后,对除ITR序列以外的基因组序列进行序列测定。同时从纯化病毒提取病毒核酸,经体外变性和退火获得双链病毒基因组DNA,经凝胶电泳分离后,切胶回收约4.7kb的AAAV双股基因组DNA,用Taq酶在基因组DNA的3′端添加“A”碱基后,用TA克隆法克隆入pCR2.1载体,获得了含AAAV全基因组的重组质粒pAAAV并进行序列测定。将两种克隆方法获得的基因组序列进行比对,结果序列完全一致。序列测定结果显示,全基因组全长度为4684个碱基,与AAAV VR-865株和DA-1株核苷酸序列同源性分别为95.0%和92.1%;ITR长度为119核苷酸,可形成典型的回文结构,D区由22个碱基组成,含4个串连GAGY重复序列的Rcp蛋白结合元件(RBE),末端裂解位点(TRS)序列为TGGCCA;左侧Rep78阅读框由1995nt组成,编码664个氨基酸,与AAAV DA-1株和VR-865株的核苷酸同源性分别为96.6%和95.2%,氨基酸序列同源性分别为99.2%和95.6%;右侧最大的阅读框编码VP1蛋白,由2217个碱基组成,编码738个氨基酸,与AAAV DA-1株和VR-865株的核苷酸同源性分别为94.1%和89.9%,氨基酸序列同源性分别为95.3%和88.6%;编码VP3的阅读框由1608个碱基组成,编码535个氨基酸,与AAAV DA-1株和VR-865株的氨基酸序列同源性分别为94.2%和91.6%。为了进一步阐明AAAV与其它AAV的遗传进化关系,将AAAV YZ-1株、DA-1株和VR-865株全基因组序列与其它9株AAV以及鹅细小病毒B株(GPV-B)基因组序列进行同源性比较,并构建遗传进化树。结果显示3株AAAV与人及其他哺乳动物AAV分离株的核苷酸同源性在55.0%～59.7%之间(与人源AAV-2的同源性最高,与牛源AAV的同源性最低),与GPV-B株的同源性在51.4%～52.2%。YZ-1株、DA-1株和VR-865株处于遗传进化树的一个独特分支上。结果表明,禽源AAV与人及哺乳动物源AAV以及属于细小病毒属的GPV遗传关系较远。三、AAAV蛋白的表达与鉴定为了制备针对AAAV Rep和Cap蛋白的特异抗血清,分别将AAAV的Rep78基因和VP3基因克隆入原核表达载体pET-47b,转化BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析,结果显示表达的Rep78蛋白分子量约为82kDa,VP3蛋白分子量约为56kDa;Western blot分析显示,表达的两种蛋白均能与AAAV抗血清反应;将目的蛋白切胶免疫BALB/c小鼠,分别制备了针对两种蛋白的多克隆抗血清,与AAAV抗原呈间接免疫荧光试验(IFA)阳性反应,与鸡胚致死孤儿病毒(CELO)呈阴性反应;Western blot分析显示,VP3蛋白抗血清能特异识别AAAV的三种结构蛋白VP1、VP2、VP3;将Rep-Cap阅读框插入真核表达质粒pcDNA3.0,用获得的重组质粒pcDNA-Rep-Cap转染293T细胞,分别以Rep78和VP3抗血清为一抗进行IFA检测,结果均为阳性;对转染细胞裂解产物进行Western blot分析,VP3抗血清可识别VP1、VP2、VP3三种结构蛋白,Rep78抗血清可识别Rep78和Rep52两种非结构蛋白。这些试验结果表明,pcDNA-Rep-Cap中的两个阅读框均能正确表达,可作为制备重组AAAV的包装质粒。四、感染性AAAV的拯救为了探明克隆的AAAV YZ-1株全基因组序列是否能拯救出感染性病毒,用5′端ITR缺失96nt的重组质粒pSM525转染CELO病毒感染的鸡胚肝(CEL)细胞系,将1:100稀释的转染细胞裂解上清在CEL细胞上传5代,用PCR对细胞裂解上清进行检测,可扩增出特异的450bp AAAV Cap基因片段;取细胞裂解上清进行电镜检查,可以观察到预期的20～25nm病毒粒子;Western blot分析结果显示,拯救病毒的三种结构蛋白分子量正确。将pSM525质粒与表达AAV-5 E2a、E4和VA RNA基因的辅助质粒pAd12共转染293细胞,细胞裂解上清经电镜检查,可以观察到典型的AAAV病毒粒子;细胞裂解上清经DNA酶Ⅰ处理后,与CELO病毒共接种SPF鸡胚,致死的鸡胚尿囊液用PCR检测,可以扩增到预期的450bp和1.9kb的AAAV特异片段。这些试验结果说明,含人腺病毒5型辅助基因的pAd12质粒同样可以支持pSM525质粒的拯救。上述试验结果表明,用含AAAV YZ-1株全基因组的重组质粒能够拯救出感染性病毒,重组质粒包含与AAAV复制和包装所需的所有关键序列,而且ITR区的部分碱基缺失不影响感染性病毒的拯救,为深入研究AAAV复制、基因表达以及重组载体构建奠定了基础。