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目的 构建含HIV-1的反式激活蛋白Tat蛋白转导结构域(Tat-protein transduction domain,TatPTD)的人碱性成纤维细胞生长因子(human basic Fibroblast Growth Factor,hbFGF)表达载体,诱导表达并对表达产物进行分离纯化,用纯化的融合蛋白做细胞因子活性检测及研究含TatPTD介导的hbFGF在体外细胞实验中跨膜转运作用。方法 用RT-PCR法扩增TatPTD-hbFGF的基因片段,扩增产物与T-Vector连接,构建表达载体pGEM-T-TatPTD-hbFGF。在宿主菌中扩增重组质粒,提取质粒并进行酶切纯化,将目的基因插入pET-28b中构建成表达载体,转化入大肠杆菌XL1-blue,蓝白选择、耐药性标记粗筛并挑取阳性克隆,经限制性内切酶酶谱分析、DNA序列分析两种方法鉴定。然后提取重组质粒,转化入大肠杆菌BL-21,用IPTG诱导表达。包涵体形式表达的融合蛋白经去污剂变性,梯度透析后,穿阴离子交换树脂,得到所需纯化目的蛋白。对纯化目的蛋白用ECV304细胞做MTT细胞因子活性检测。并用免疫细胞化学方法对含TatPTD的hbFGF与不含TatPTD的hbFGF在生物膜穿透性方面进行初步研究。结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证明所构建质粒为pET-28b-TatPTD-hbFGF重组质粒;SDS-PAGE证实获得的融合蛋白分子量为21.5kD,表达量约占菌体总蛋白的24%。纯化的蛋白纯度为99%;免疫细胞化学研究表明,含TatPTD的hbFGF要比不含TatPTD的hbFGF在ECV304细胞中含量明显高。结论 成功获得TatPTD-hbFGF表达载体,并在大肠杆菌中获得表达,纯化的融合蛋白具有细胞因子的活性,且具有明显透过生物膜作用。