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背景和目的：
间质性肺疾病(Interstitial lung disease，ILD)是一大组以弥漫性肺泡炎及间质纤维化为主要病理特征的疾病，临床表现高度异质性。其中特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)为最常见类型，死亡率高。研究发现免疫源性及神经源性降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related pepti de，CGRP)分布和功能均存在明显差异，其比例失调可调节肺部免疫反应，因此我们推测CGRP表达异常可能影响肺纤维化进程，但其究竟是神经源性还是免疫源性CGRP起作用目前尚不得知。研究发现肺泡上皮细胞(Alveola r epithelial cell，AEC)加速凋亡并可诱发不可逆的肺纤维化。我们前期发现在ILD中水通道蛋白5(Aquaporins 5，AQP5)高频突变、导致AQP5表达下调造成AEC过度凋亡，进一步研究发现AQP5表达受控于免疫源性和神经源性CGRP的比例平衡。根据文献以及之前的研究结果，我们推测CGRP可能通过调控AQP5低表达，通过AKT信号通路使TGF-β1上调表达导致肺泡上皮细胞过度凋亡、成纤维细胞增殖、胶原沉积和肺纤维化形成。
方法：
(1)分析ILD患者的临床病理及影像学特征、外周血免疫细胞亚群情况(T细胞和NK细胞)和Th1/Th2细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10与IFN-γ)；
(2)CGRP和AQP5基因测序分析：抽提60例ILD患者与180例健康对照的全血DNA，PCR扩增之后，直接测序分析，对突变与多态性位点进行定位并分析；
(3)ELISA法测定AQP5、α-CGRP、β-CGRP、CGRP受体(CGRP-RCP、CRLR)；炎症指标：IFN-γ，纤维化指标：BAX、ACTA2、BCL、E-CAD、TGF-β1等；
(4)博来霉素造模(肺纤维化鼠模型)：肺组织HE染色判断炎症的性质，MASSON染色判断肺纤维化程度，免疫荧光、Westernblot(WB)等验证相关蛋白的表达情况；
(5)利用CRISPR/cas9技术获得α-CGRP敲除(CALCA-KO)鼠，并通过病理学、血清学、WB等验证CALCA-KO是否出现肺炎和纤维化过程；
(6)通过比较自建的CALCA-KO模型与经典的博来霉素诱导模型和正常对照分析：1)肺组织病理特征、凋亡水平及免疫细胞表达：取三组肺组织行H&E染色、Masson、TUNEL(TdT-mediated dUTP-FITC nick end-labeling)法及免疫组化法等；2)采用Westernblot法对可能的通路蛋白进行验证。
结果：
(1)ILD患者影像学均表现为双肺纹理增粗，见条索状、斑片状、结节状密度增高影，边缘模糊，指示着肺间质性病变；病理可见肺泡间隔稍增宽，淋巴细胞浸润；血清提示T淋巴细胞激活，CD4+/CD8+比例失调，进一步研究发现Th2细胞因子IL-4、IL-6、IL-10较Th1细胞因子IL-2明显增高，IL-4、IL-6、IL-10与IFN-γ的比值明显高于Th1细胞因子IL-2与IFN-γ的比值。
(2)ILD患者中发现AQP5基因1号内含子的剪切区域出现高频突变(48/60 )，突变模式多样化(IVS_1+12-14DelGGG、IVS_1+14-15insG、IVS_1+12-14DelGGG+12DelG和IVS_1+12DelG)；而且CALCA直接测序结果也发现3号内含子在疾病组中存在突变主要为：c.224G+846C>T和c.224G+848G>C。
(3)ILD患者血清α-CGRP(114.33±41.88ng/mL)高于正常对照组(76.80±13.75ng/mL)(P=0.012)，ILD患者血清β-CGRP与对照之间无统计学意义，P>0.05；ILD患者血清AQP5(1062.41±35.96ng/mL)高于正常对照组(778.03±42.43ng/mL)(P<0.0001)；神经源性CGRP与AQP5呈显著正相关，r=0.9410，p<0.0001，免疫源性与神经源性CGRP比值与AQP5呈正相关，r=0.8353，p<0.0001，而神经源性与免疫源性CGRP相对值与AQP5呈负相关，r=0.5832，p<0.0001。
(4)ILD患者的血清IL-6(45.37±1.25ng/mL)显著高于正常对照组(34.10±1.69ng/mL)，P<0.0001；在自身免疫性疾病组内比较中发现ILD患者的血清IL-6比AIP(自身免疫性胰腺炎)患者更高，P=0.029；而且ILD患者血清IFN-γ(89.27±2.10ng/mL)也高于正常对照组(65.32±3.68ng/mL，P<0.0001，可能为ILD晚期代偿性升高。
(5)ILD患者的血清受体活性修饰蛋白1(Receptor activity-modifying protein-1，RAMP1)(7.36±0.27ng/mL)高于正常对照组(3.87±0.44ng/mL)，P<0.0001，但在自身免疫性疾病组内对比中发现ILD患者和AIP患者之间无统计学意义，P=0.089；ILD患者的血清降钙素基因相关肽受体成分蛋白(Calcitonin Gene Related Peptide-Receptor Component Protein ， CGRP-RCP )((242.43±8.12ng/mL)高于正常对照(196.01±11.98ng/mL)，P值为0.02。
(6)博莱霉素(BLM)造模：H&E染色、Masson法证实肺纤维化，肺泡炎高峰出现在博莱霉素注射后第7天，第28天肺部出现弥漫性纤维化。BLM组第28天小鼠模型肺组织的凋亡程度显著增加，同时CD3+T细胞和TGF-β1表达高于正常组。Westernblot结果发现BLM组与正常组比较，鼠肺组织AQP5在早期肺泡炎期减少，晚期纤维化期代偿性表达增加，但仍低于正常组，上皮表型标志物(Ecad)和间质表型标志物(ACTA)表达均上调，在BLM组第28天β-CGRP及α-CGRP表达均增加，且β-CGRP较α-CGRP显著增加，β-CGRP与α-CGRP比值升高，AKT、BAX及TGF-β1表达增加。
(7)CALCA-KO鼠的肺组织病理见大量炎症细胞浸润、肺泡结构破坏、符合肺纤维化早期病程。
(8)在CALCA-KO组中AQP5、AKT、BAX及ECAD的表达明显增加，但TGF-β1表达明显减少。与BLM组内比较发现AQP5表达增加，β-CGRP表达降低，免疫源性与神经源性CGRP比值降低。
结论：
1、间质性肺疾病存在T淋巴细胞异常激活：Th1/Th2失衡等自身免疫紊乱，为Th2免疫表型为主的自身免疫性疾病。
2、ILD患者外周血检出CGRP和AQP5基因高频突变，CGRP高表达，且免疫源性及神经源性CGRP比例失调，该比例与AQP5的表达正相关，免疫源性及神经源性CGRP比例可调控AQP5导致肺纤维化，CGRP和AQP5可能为ILD疾病发生发展的重要驱动因子。
3、在肺纤维化动物模型中支持免疫源性与神经源性CGRP比值与AQP5呈正相关，并且发现神经源性CGRP可通过AKT信号使TGF-β1表达上调，导致肺间质细胞增生，肺泡上皮细胞的脱落、调控AQP5表达下降导致肺纤维化。
间质性肺疾病(Interstitial lung disease，ILD)是一大组以弥漫性肺泡炎及间质纤维化为主要病理特征的疾病，临床表现高度异质性。其中特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)为最常见类型，死亡率高。研究发现免疫源性及神经源性降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related pepti de，CGRP)分布和功能均存在明显差异，其比例失调可调节肺部免疫反应，因此我们推测CGRP表达异常可能影响肺纤维化进程，但其究竟是神经源性还是免疫源性CGRP起作用目前尚不得知。研究发现肺泡上皮细胞(Alveola r epithelial cell，AEC)加速凋亡并可诱发不可逆的肺纤维化。我们前期发现在ILD中水通道蛋白5(Aquaporins 5，AQP5)高频突变、导致AQP5表达下调造成AEC过度凋亡，进一步研究发现AQP5表达受控于免疫源性和神经源性CGRP的比例平衡。根据文献以及之前的研究结果，我们推测CGRP可能通过调控AQP5低表达，通过AKT信号通路使TGF-β1上调表达导致肺泡上皮细胞过度凋亡、成纤维细胞增殖、胶原沉积和肺纤维化形成。
方法：
(1)分析ILD患者的临床病理及影像学特征、外周血免疫细胞亚群情况(T细胞和NK细胞)和Th1/Th2细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10与IFN-γ)；
(2)CGRP和AQP5基因测序分析：抽提60例ILD患者与180例健康对照的全血DNA，PCR扩增之后，直接测序分析，对突变与多态性位点进行定位并分析；
(3)ELISA法测定AQP5、α-CGRP、β-CGRP、CGRP受体(CGRP-RCP、CRLR)；炎症指标：IFN-γ，纤维化指标：BAX、ACTA2、BCL、E-CAD、TGF-β1等；
(4)博来霉素造模(肺纤维化鼠模型)：肺组织HE染色判断炎症的性质，MASSON染色判断肺纤维化程度，免疫荧光、Westernblot(WB)等验证相关蛋白的表达情况；
(5)利用CRISPR/cas9技术获得α-CGRP敲除(CALCA-KO)鼠，并通过病理学、血清学、WB等验证CALCA-KO是否出现肺炎和纤维化过程；
(6)通过比较自建的CALCA-KO模型与经典的博来霉素诱导模型和正常对照分析：1)肺组织病理特征、凋亡水平及免疫细胞表达：取三组肺组织行H&E染色、Masson、TUNEL(TdT-mediated dUTP-FITC nick end-labeling)法及免疫组化法等；2)采用Westernblot法对可能的通路蛋白进行验证。
结果：
(1)ILD患者影像学均表现为双肺纹理增粗，见条索状、斑片状、结节状密度增高影，边缘模糊，指示着肺间质性病变；病理可见肺泡间隔稍增宽，淋巴细胞浸润；血清提示T淋巴细胞激活，CD4+/CD8+比例失调，进一步研究发现Th2细胞因子IL-4、IL-6、IL-10较Th1细胞因子IL-2明显增高，IL-4、IL-6、IL-10与IFN-γ的比值明显高于Th1细胞因子IL-2与IFN-γ的比值。
(2)ILD患者中发现AQP5基因1号内含子的剪切区域出现高频突变(48/60 )，突变模式多样化(IVS_1+12-14DelGGG、IVS_1+14-15insG、IVS_1+12-14DelGGG+12DelG和IVS_1+12DelG)；而且CALCA直接测序结果也发现3号内含子在疾病组中存在突变主要为：c.224G+846C>T和c.224G+848G>C。
(3)ILD患者血清α-CGRP(114.33±41.88ng/mL)高于正常对照组(76.80±13.75ng/mL)(P=0.012)，ILD患者血清β-CGRP与对照之间无统计学意义，P>0.05；ILD患者血清AQP5(1062.41±35.96ng/mL)高于正常对照组(778.03±42.43ng/mL)(P<0.0001)；神经源性CGRP与AQP5呈显著正相关，r=0.9410，p<0.0001，免疫源性与神经源性CGRP比值与AQP5呈正相关，r=0.8353，p<0.0001，而神经源性与免疫源性CGRP相对值与AQP5呈负相关，r=0.5832，p<0.0001。
(4)ILD患者的血清IL-6(45.37±1.25ng/mL)显著高于正常对照组(34.10±1.69ng/mL)，P<0.0001；在自身免疫性疾病组内比较中发现ILD患者的血清IL-6比AIP(自身免疫性胰腺炎)患者更高，P=0.029；而且ILD患者血清IFN-γ(89.27±2.10ng/mL)也高于正常对照组(65.32±3.68ng/mL，P<0.0001，可能为ILD晚期代偿性升高。
(5)ILD患者的血清受体活性修饰蛋白1(Receptor activity-modifying protein-1，RAMP1)(7.36±0.27ng/mL)高于正常对照组(3.87±0.44ng/mL)，P<0.0001，但在自身免疫性疾病组内对比中发现ILD患者和AIP患者之间无统计学意义，P=0.089；ILD患者的血清降钙素基因相关肽受体成分蛋白(Calcitonin Gene Related Peptide-Receptor Component Protein ， CGRP-RCP )((242.43±8.12ng/mL)高于正常对照(196.01±11.98ng/mL)，P值为0.02。
(6)博莱霉素(BLM)造模：H&E染色、Masson法证实肺纤维化，肺泡炎高峰出现在博莱霉素注射后第7天，第28天肺部出现弥漫性纤维化。BLM组第28天小鼠模型肺组织的凋亡程度显著增加，同时CD3+T细胞和TGF-β1表达高于正常组。Westernblot结果发现BLM组与正常组比较，鼠肺组织AQP5在早期肺泡炎期减少，晚期纤维化期代偿性表达增加，但仍低于正常组，上皮表型标志物(Ecad)和间质表型标志物(ACTA)表达均上调，在BLM组第28天β-CGRP及α-CGRP表达均增加，且β-CGRP较α-CGRP显著增加，β-CGRP与α-CGRP比值升高，AKT、BAX及TGF-β1表达增加。
(7)CALCA-KO鼠的肺组织病理见大量炎症细胞浸润、肺泡结构破坏、符合肺纤维化早期病程。
(8)在CALCA-KO组中AQP5、AKT、BAX及ECAD的表达明显增加，但TGF-β1表达明显减少。与BLM组内比较发现AQP5表达增加，β-CGRP表达降低，免疫源性与神经源性CGRP比值降低。
结论：
1、间质性肺疾病存在T淋巴细胞异常激活：Th1/Th2失衡等自身免疫紊乱，为Th2免疫表型为主的自身免疫性疾病。
2、ILD患者外周血检出CGRP和AQP5基因高频突变，CGRP高表达，且免疫源性及神经源性CGRP比例失调，该比例与AQP5的表达正相关，免疫源性及神经源性CGRP比例可调控AQP5导致肺纤维化，CGRP和AQP5可能为ILD疾病发生发展的重要驱动因子。
3、在肺纤维化动物模型中支持免疫源性与神经源性CGRP比值与AQP5呈正相关，并且发现神经源性CGRP可通过AKT信号使TGF-β1表达上调，导致肺间质细胞增生，肺泡上皮细胞的脱落、调控AQP5表达下降导致肺纤维化。