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NR6A1是核受体亚家族6成员1,其配体未知,属于孤儿核受体,又称生殖细胞核因子。已有的研究表明,NR6A1在发育中的胎盘、神经系统、成年人类和动物睾丸、卵巢及大多数肿瘤组织中均有表达,其功能主要涉及细胞分化、发育和肿瘤的形成,但其转录调控方面的分子机制尚不清楚。本研究首先分别克隆了人及小鼠NR6A1基因启动子的全长及各截短序列。随后,分别构建了 NR6A1基因启动子全长及不同截短序列的荧光素酶报告基因表达体系,并分别转染永生化小鼠B型精原细胞GC-1、正常小鼠睾丸Sertoli细胞TM4、人睾丸畸胎瘤细胞NT-2和人胚肾细胞293等细胞系,检测各启动子片段的转录活性。实验结果显示,鼠源Nr6a1基因启动子的核心区域位于-169bp～+78bp处;人源NR6A1基因启动子的核心区域位于-280 bp～+168 bp处,它们均具有最强的转录活性。生物信息学分析显示,SP1、KLF5、KLF4、CREB1、E2F6和Mafb等6个转录因子结合位点是人、鼠Nr6a1核心启动子区共有的,已知SP1、KLF5和KLF4同属于KLF家族成员,而6个不同转录因子中有3种是KLF家族因子,同时还发现两个启动子区都富集SP1结合位点,提示转录因子SP1对NR6A1的转录调控具有重要作用。进一步利用SP1 ORF表达载体,再结合荧光素酶报告基因实验发现,在TM4、GC-1和293细胞系中,NR6A1启动子区在SP1的作用下活性均增强,且发现不同片段的启动子区活性与SP1结合位点的个数无关,并无叠加效应。同时,利用SP1的si-RNA干扰序列,在293和NT-2细胞系中验证了敲低SP1后,NR6A1启动子活性下降。这些实验证实了 SP1对NR6A1启动子的转录活性具有正向调控作用。此外还发现启动子区靠近起始密码子的SP1结合位点发挥的转录调控作用可能比远端的更强一些。最后,本研究探讨了 SP1在NR6A1响应氧化损伤过程中的调控作用。以H2O2为氧化剂,建立了 NT-2细胞氧化损伤模型。用0～70μM的H202处理细胞12h,细胞形态学观察、生化检测等方法显示,随着H202浓度的升高,细胞由圆润饱满逐渐变的皱缩扁平,逐渐失去接触,生长受到抑制,细胞超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的活力降低,谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的含量减少,而脂质氧化产物(Malondialdehyde,MDA)的含量上升,说明H202对细胞造成了氧化损伤。在此基础上,采用定量PCR和Western Blot技术分析发现,在H202的作用下,SP1和NR6A1的mRNA和蛋白表达水平均明显上调。结合荧光素酶报告基因实验,进一步验证了 NR6A1基因启动子区全长和截短片段的活性在H202作用下显著增强,提示了在氧化应激下NR6A1基因的表达与其启动子活性密切相关。当利用si-RNA干扰序列敲低NT-2细胞氧化损伤模型中的SP1基因之后,通过RT-qPCR方法发现NR6A1基因在mRNA水平的表达也随之减少,说明SP1参与了 NR6A1基因对H202损伤信号的响应。综上,本研究克隆了人及小鼠NR6A1基因启动子序列,确定了其核心启动子区域,证实了 SP1对NR6A1启动子转录活性具有正调控作用,且NR6A1可能通过SP1应答氧化损伤信号。这些研究结果为阐述NR6A1基因的转录调控机制奠定了基础。