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研究背景:子痫前期(Preeclampsia,PE)是妊娠期特有的临床综合征,以妊娠20周后出现新发高血压和蛋白尿为主要特点,其发病率约为2-9.4%。PE是发展中国家产妇死亡和发病的主要原因之一,但是PE发生发展的病理机制尚不清楚。目前,PE发展进程可分为以下两个阶段:第一阶段是胚胎滋养层入侵到母体子宫肌层,导致子宫螺旋动脉重塑不足,从而使胎盘陷入缺血和缺氧环境,引发胎盘释放多种促炎细胞因子和血管生成因子等,引起母体全身炎症。第二阶段,全身炎症反应所导致的母体血管系统的内皮功能障碍与肾功能下降引起的血压升高为此阶段的主要特征,最终引起以母体高血压和蛋白尿为主要表现的临床综合征。缓解母体症状的唯一有效途径是胎盘和胎儿的娩出。既往研究表明,PE患者的胎盘氧化应激反应失衡,并且胎盘局部氧化应激过度,可诱发滋养细胞生物学功能损伤,导致滋养细胞凋亡增加和侵袭能力下降,引起母亲系统性血管内皮功能失调和白细胞激活;而Keap1/Nrf2信号通路则在PE的氧化应激损伤中发挥保护作用,但是其作用机制尚不清楚。因此,深入探讨PE的氧化应激发生机制,寻求有效的治疗靶点,对缓解PE患者症状、延长胎儿在母体时间、降低PE患者死亡率具有重要临床意义。氧化应激(Oxidative Stress,OS)是机体的应激反应,即体内的活性氧族(Reactive Oxygen Species,ROS)及活性氮族(Reactive Nitrogen Species,RNS)产生过多,清除过少,最终导致氧化/抗氧化体系失衡,倾向于氧化,引起组织损伤。与非妊娠状态相比,正常妊娠期间母体活性氧生成量量增加。随着胎盘成熟,血.管形成,胎盘被变成富氧环境,活性氧的增加刺激妊娠期间抗氧化系统的增强。增强的抗氧化系统有效补偿了 OS的氧化作用。与正常妊娠相比,PE患者OS表达增加和抗氧化系统的表达增强,其特征在于活性氧(ROS)在循环和组织中表达增加。既往研究结果显示 Keapl(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1)/Nrf2(nuclear factor-E2-related factor 2)信号通路在抗氧化、抗炎方面扮演了重要的角色。正常状态下,细胞质中的Nrf2与其负调控因子Keap1结合形成Keap1/Nrf2复合物,大部分Nrf2被Keap1介导的泛素化降解,因此其处于活性相对抑制状态;而应激的状态会引起Keap1构象的改变,或者由高度活性的氧化物直接促使Nrf2磷酸化,导致Nrf2与Keap1解离而活化,活化的Nrf2进入细胞核,形成下一步连锁反应,从而与抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)的结构相结合,激活下游的多种抗氧化基因。因此Keap1/Nrf2信号调节通路在PE的发病过程中有着重要的作用,研究该机制具有重要临床意义。目的:1.明确不同分组氧化应激水平的变化及Nrf2对于氧化应激水平的抑制作用。通过检测不同分组HTR8/SVneo细胞内CAT、GSH-Px、SOD酶活性,进一步明确Nrf2对于氧化应激相关活性酶作用的机制。2.在前期实验工作基础上,进一步从细胞水平-临床水平,采用蛋白印迹杂交、qRT-PCR、siRNA、ELISA等相关技术手段的,明确Keap1/Nrf2通路对PE细胞模型中滋养细胞HTR8/SVneo生物学功能以及PE患者氧化应激水平的影响。方法:对于人早孕期绒毛外滋养细胞株HTR8/SVneo进行细胞培养、复苏、传代。通过活性氧及氧化应激相关酶CAT、GSH-Px及SOD酶活性的测定,以明确不同分组HTR8/Svneo及胎盘组织氧化应激水平;并通过检测血浆MMPs预测子痫前期的发病风险。应用RNAi方法设计siRNA-Nrf2,对靶基因进行基因沉默实验,以明确靶基因的功能;应用qRT-PCR方法确认Keap1/Nrf2通路与氧化应激相关分子的转录水平的差异,Western blot方法确认Keap1/Nrf2通路与氧化应激相关分子蛋白的表达差异。采用SPSS 21.0统计软件,计量资料以均数土标准差(Means±SD)表示,两组间均数的比较采用t检验,多组间的比较用单因素方差分析(one-wayANOVA),P<0.05、P<0.01或P<0.001均为有统计学意义。结果:1.qRT-PCR检测转染慢病毒后Nrf2mRNA表达结果示:Si-Nrf2组较Si-NC组Nrf2mRNA的表达量明显减低(P<0.001);蛋白免疫印迹法检测Nrf2蛋白的表达量,结果显示:Si-Nrf2组较Si-NC组明显降低,差异有显著统计学意义(P<0.001)。2.HTR8/SVneo细胞H/R组ROS水平与Non-treated组相比明显升高(p<0.01);对Nrf2进行基因沉默后,Nrf2siRNA+H/R组ROS水平与H/R组相比明显增高(p<0.01)。3.HTR8/SVneo细胞在缺氧/复氧条件下,氧化应激相关酶(CAT、GSH-Px、SOD)活性显著低于处理前,这体现在H/R组氧化应激酶水平较正常对照组明显降低(P<0.001)。SiRNA+H/R 组 HTR8/SVneo 细胞内 CAT、GSH-Px、SOD 活性下降显著(P<0.01)。4.缺氧复氧后HTR8/SVneo细胞Keap1 mRNA表达轻度低于正常对照(P<0.05);HTR8/SVneo细胞缺氧复氧后Nrf2 mRNA表达明显高于正常对照组(P<0.001);HTR8/SVneo细胞缺氧复氧后HO-1 mRNA表达水平明显高于正常细胞(P<0.001)。5.HTR8/SVneo细胞缺氧复氧后Keap1蛋白表达水平明显低于正常对照组（P<0.05);而缺氧复氧后HTR8/SVneo细胞Nrf2蛋白表达水平明显于正常细胞(P<0.001);HO-1蛋白表达水平在缺氧复氧后也明显高于正常细胞(P<0.001)。6.正常孕妇和重度子痫前期患者的孕周、收缩压、舒张压以及新生儿体重均存在统计学差异。7.孕中期PE患者的MMP-2水平高于正常参与者。但没有统计学意义(P>0.05)。另一方面,PE患者MMP-9血浆水平略低于正常怀孕组,差异有统计学意义(P<0.05)。比较MMP-2/MMP-9比率,发现PE组的比率明显高于正常妊娠组,差异有显著统计学意义(P<0.001)。MMP-2用于预测PE的ROC曲线下面积仅为0.563,95%置信区间(CI)为 0.497-0.629(P>0.05)。而 MMP-9 的预测 PE 的 ROC 曲线下面积为 0.587,95%CI为0.522-0.652,差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线下使用MMP-2/MMP-9比率预测PE的曲线下面积为0.841,95%CI为0.797-0.886(P<0.001)。8.重度子痫前期患者胎盘组织CAT(P<0.001)、GSH-Px(P<0.01)、SOD(P<0.01)酶活性均低于正常胎盘组织。9.重度子痫前期患者胎盘组织Keap1 mRNA表达水平稍低于与正常胎盘组织(P<0.05);重度子痫前期患者胎盘组织Nrf2mRNA表达水平明显高于与正常胎盘组织(P<0.001);重度子痫前期患者胎盘组织HO-1mRNA表达水平明显高于与正常胎盘组织(P<0.001)。10.重度子痫前期患者胎盘组织Keap1蛋白表达水平稍低于与正常胎盘组织(P<0.05);重度子痫前期患者胎盘组织Nrf2蛋白表达水平明显高于与正常胎盘组织(P<0.01);重度子痫前期患者胎盘组织HO-1蛋白表达水平明显高于与正常胎盘组织(P<0.01)。结论:本研究通过检测不同类型HTR8/SVneo细胞内活性氧、CAT、GSH-Px、SOD酶活性,进一步明确氧化应激时活性氧水平上升、其相关酶活性下降及Nrf2对于氧化应激相关活性酶作用的机制;在mRNA及蛋白水平,Keap1/Nrf2信号通路在缺氧复氧状态下表达水平明显改变,提示可通过调节Keap1/Nrf2信号通路抑制氧化应激的水平。孕中期患者血浆MMPs水平对子痫前期有重要的预测意义。不同样本的氧化应激相关活性酶因临床状态不同而有明显差异;重度子痫前期患者胎盘组织Nrf2,HO-1 mRNA及蛋白表达水平明显高于与正常胎盘组织,而Keap1低于正常,提示Keap1/Nrf2信号通路在重度子痫前期患者表达水平发生明显变化,所以调节Keap1/Nrf2信号通路可减缓子痫前期的发病。