蚊虫是世界上最重要的卫生害虫之一,是疟疾、黄热病、登革热等重要卫生疾病的传播媒介。人类对于蚊虫的防治由来已久,主要采取物理、化学、生物等方法,但是目前主要的灭蚊手段仍然是化学杀虫剂。化学药剂长期大量使用导致蚊虫产生抗药性,迫使人们加大化学药剂的用量,最终破坏生态环境、杀伤非靶标昆虫、危害人类健康。随着害虫综合治理的发展,多种生物防治技术已经被广泛应用。对于蚊虫防治来说,利用高效且便于使用的生防菌是未来发展的趋势所在。贵阳腐霉作为一种潜在杀蚊病原菌,存在许多优点,比如杀虫活力好、易于在实验室培养、生长繁殖快等。本文通过观察贵阳腐霉侵染蚊虫的具体途径以及侵染过程,全面评估贵阳腐霉作为昆虫病原菌防治蚊虫的可能性,同时进一步为贵阳腐霉提高对蚊虫的防治效果提供理论依据;对贵阳腐霉PKA03242基因功能的研究,明确该基因对病原菌毒力影响,为菌株的基因改造工程提供线索。1.贵阳腐霉对淡色库蚊侵染途径的研究本文采用扫描电子显微镜以及石蜡切片观察贵阳腐霉侵染蚊虫途径。1)体壁侵染:贵阳腐霉的游动孢子可以大量在蚊虫体表聚集,其粘附部位由蚊虫的身体结构所决定,同时游动孢子也会通过两游现象去寻找寄主。在粘附期间游动孢子会产生一系列的胞外水解酶,降解体壁。2h左右,游动孢子开始产生乳突状的结构;4h-8h,侵染菌丝逐渐萌发、延伸;12h左右,侵染菌丝借助本身生长所产生的机械压力,并且凭借水解酶的协助,穿透体表,进入昆虫体内;16h左右,菌丝开始定殖,有大量新生菌丝生成;24h,菌丝从昆虫体内长出;48h,长出体外的菌丝产生孢子囊,形成新的一轮侵染循环。2)肠道侵染:将贵阳腐霉菌丝与淡色库蚊幼虫放在同一个培养皿内,发现幼虫取食贵阳腐霉菌丝。取食8h之后,横切蚊虫体段,通过电镜观察发现肠道内充满菌丝;提取肠道以及排泄物,在V8培养基上培养生成菌丝,提取菌丝DNA并利用特异性引物扩增,发现该菌丝为贵阳腐霉。提取取食2h、4h、12h、24h幼虫的肠道,发现肠道产生黑化现象,并且随着时间的推移黑化程度加强。通过石蜡切片观察,正常蚊虫的肠壁细胞排列整齐且紧实;取食2h左右,肠壁细胞并没有发生变化;处理4h-12h,肠壁细胞逐渐降解,排列疏松;处理24h,肠壁与血腔融合;处理36h,菌丝在幼虫体内大量生长,最终从身体内穿出。2.贵阳腐霉中PK403242基因功能的研究对贵阳腐霉中一个保守的Protein kinase A 03242基因的功能进行系统地研究。采用RNAi方法沉默该基因,分析表型发现,PKA03242沉默转化子菌丝形态发生改变、生长速率显著降低、游动孢子数量减少。表达量动态分析显示,PKA03242在贵阳腐霉各个生长阶段相对表达量一致,但是在侵染阶段明显上调表达。沉默该基因之后,严重削弱了其对蚊虫的感染能力以及致死能力。另外,沉默转化子对H2O2的敏感性增加,但是对盐胁迫的敏感性明显低于对照组。