人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)是最早从人血浆中提取、大规模生产并应用于临床的血液制品。作为血浆中含量最高的蛋白质,HSA在人体中发挥着重要的生理作用。受原料血浆的限制,HSA常出现供不应求的状况。目前,国内外生产企业主要采用低温乙醇法制备HSA,且基本采用固定的工艺参数进行控制。由于个体差异等因素,来自不同捐献者的血浆蛋白含量、构成均存在差异,采用固定的工艺参数易造成原料血浆的浪费。因此,深入研究血浆蛋白的醇沉机制,针对不同来源的血浆采用质量源于设计的生产理念,提高产品的收率和质量,一直是科研工作者探索的方向。乙醇沉淀过程是HSA分离纯化的核心,但目前HSA的醇沉机制尚不完全明确,在一定程度上限制了对HSA生理学功能的理解和高品质血浆蛋白制品的获得。HSA的聚集沉淀受到众多因素的影响,其分离纯化也主要基于不同参数下血浆蛋白理化性质的不同所导致的溶解与沉淀的动态平衡关系。HSA相对分子质量大,结构复杂,其在水溶液中的分子间相互作用对沉淀过程影响显著。因此,研究HSA的分子间相互作用以及分离溶液的结构是HSA沉淀过程研究的重要基础工作之一。据此,本课题主要研究了醇沉过程中,关键工艺参数(critical process parameter,CPP)乙醇和pH引起的HSA分子间相互作用变化,包括蛋白质的二级结构和水合作用等。红外光谱分析技术作为重要的分子光谱技术,在血液制品领域具有一定的应用研究基础,因其对弱氢键变化极为敏感而广泛用于研究各种化合物的氢键、水合作用和自缔合行为等,成为结构生物学研究中重要的光谱分析技术之一。水光谱组学以水为研究对象,利用光谱技术从分子水平上可以反应蛋白质与溶剂之间的相互作用。因此,本研究主要基于红外水光谱组学理论,结合蛋白质体积性质,对HSA醇沉过程的主要分子间相互作用进行了研究,包括乙醇-水二元混合体系的分子间相互作用研究、不同浓度HSA水溶液水合作用研究和乙醇浓度和pH变化引起的水溶液中HSA二级结构和水合作用变化研究。具体内容如下:1乙醇-水溶液分子间相互作用研究采用近红外(near-infrared,NIR)光谱分析技术对乙醇-水二元混合体系的分子间相互作用进行了研究。应用水光谱组学理论,利用超额光谱和高斯拟合方法对0%～10%(v/v)浓度范围的乙醇-水溶液进行分析。结果表明,水可以作为分子探针探索体系中分子间相互作用。当乙醇浓度低于5%时,溶液中分子间的主要作用形式是疏水水合作用,而当乙醇浓度高于5%时,水的O-H基团和乙醇的O-H基团之间通过氢键形成了相对固定的作用形式。同时,发现乙醇分子和水分子之间的氢键强度在乙醇浓度为40%时达到最大值,这可能解释了众多文献报道中40%浓度乙醇-水溶液的异常物理化学性质,并且可能与血浆蛋白的醇沉终点有关。通过二维相关光谱分析发现,在10%～40%的浓度下,乙醇倾向于先与水分子发生相互作用,但当乙醇浓度进一步升高时,乙醇分子之间的自缔合作用优先发生,从而导致乙醇与水分子之间的相互作用减弱。该项研究为乙醇引起的体系中氢键网络的变化提供了重要的理论支持。乙醇是HSA醇沉过程中的重要溶剂,乙醇-水溶液体系的研究对血浆蛋白的分离和纯化具有至关重要的现实意义。从分子水平上深入了解乙醇-水二元体系中不同血浆蛋白的水合行为,有望获得高品质的血浆蛋白产品和最大限度地利用有限的血浆资源。2不同浓度HSA水溶液的水合作用研究采用NIR光谱分析技术研究了 HSA作为扰动因素引起的水结构变化。不同HSA浓度下,水的摩尔吸光系数结果表明,HSA引起的水溶液摩尔吸光系数的变化是非线性的。采用McCabe-Fisher方法对NIR差谱进行解析,获得了不同浓度HSA的水合光谱和水合分子数。采用共球交盖模型和水氢键网络变化,对水合分子数随着HSA浓度增加而降低的现象进行了解释。应用水光谱组学理论,对HSA水合光谱中不同的水物种成分进行了高斯解析,发现自由水存在于HSA的水合层中,且不同的HSA浓度下,水合层中不同氢键结合水是动态变化的。HSA的加入促进了水合层形成更加有序的氢键网络结构,即在高浓度HSA溶液中,蛋白质通过抑制水分子之间氢键的断裂,在蛋白表面形成了较完整的氢键网络。当HSA浓度高于10 mg/mL时,氢键网络中的3个氢键和4个氢键结合的水物种达到平衡。这些发现为HSA的分离纯化提供了重要的理论支持。同时,通过了解HSA水溶液的水合作用,为蛋白质水合行为的研究提供了新的方法和观点。3酸性pH下HSA二级结构和水合作用变化研究利用中红外(middle-infrared,MIR)光谱考察了 pH对水溶液中HSA二级结构和侧链氢键的影响。移动窗口二维相关分析发现,当体系中pH在4.5附近时,HSA的二级结构发生明显变化,即N构象向F构象的转变。采用二维相关分析对HSA的N构象、N-F构象转变、F构象进行了分段分析,发现HSA的侧链羧基基团质子化可能诱发了二级结构的变化。同时,通过NIR差谱分析发现,蛋白质的水合作用在pH 4.5附近发生急剧减弱,意味着水合水参与了 HSA的结构变化。采用二维相关分析对NIR光谱进行研究,发现不同氢键结合的水参与了 HSA的不同构象变化过程。本部分研究对生产中所经历的酸性pH环境对HSA结构和水合作用的影响进行了探索,为pH调节提供了理论指导。4乙醇对HSA二级结构和水合作用的影响研究采用二维相关MIR光谱,考察了乙醇对水溶液中HSA二级结构和侧链氢键的影响。研究发现低浓度的乙醇具有增强HSA的α-螺旋结构的作用,同时也促进了分子间β-折叠片结构的形成,这些二级结构的变化可能始于侧链羧基基团的变化。HSA的表观摩尔体积计算结果显示,乙醇的加入,竞争了 HSA表面的水合水,造成蛋白质水合作用减弱,最终导致了 HSA的聚集沉淀。采集样品的NIR光谱,结合McCabe-Fisher方法对NIR差谱进行解析,得到HSA的水合光谱。利用水光谱组学理论,对HSA的水合光谱进行分析,发现在不同浓度乙醇影响下,HSA水合水分子结构发生了不同的变化,观察到不同氢键结合的水分子参与了 HSA的沉淀过程。该部分研究加深了对HSA醇沉机制的理解,为工艺优化提供理论支持。5乙醇和pH对HSA二级结构和水合作用的影响研究采用二维相关MIR光谱,考察了等电点pH下,乙醇对水溶液中HSA二级结构和侧链氢键的影响。在等电点pH下,乙醇主要促进了分子间β-折叠片结构的形成,即以促进蛋白质的沉淀为主。此外,低浓度乙醇也增强了α-螺旋结构的稳定性。HSA的表观摩尔体积及NIR差谱的分析结果表明等电点pH和乙醇对HSA的脱水合过程具有协同作用。采用McCabe-Fisher方法对NIR差谱进行解析,得到HSA的水合光谱,并应用水光谱组学理论对水合层水结构进行分析,发现在不同浓度乙醇影响下,HSA水合水分子结构发生了不同的变化,观察到不同氢键结合的水分子参与了 HSA的沉淀过程,为深入揭示醇沉机理奠定了基础。综上所述,本研究主要采用红外光谱分析技术,针对血浆蛋白醇沉过程中的关键工艺参数乙醇和pH变化对HSA二级结构和水合作用的影响开展了初步的机理研究。首先对简单二元体系乙醇-水溶液和HSA水溶液进行了研究,结果表明,乙醇分子和水分子在乙醇浓度为40%左右时形成强氢键作用,是导致蛋白质表面脱水合作用的主要原因。HSA水溶液的水合作用和水合层结构变化与其浓度并非线性关系,这为醇沉过程中HSA溶液稀释浓度的选择提供了参考。其次,对乙醇和pH单因素对HSA二级结构和水合作用的影响进行了研究,结果表明,酸性pH下,过低的pH环境会导致HSA二级结构的破坏,这种二级结构的变化可能始于侧链羧基基团的质子化,并且不同氢键结合程度的水参与了蛋白质的结构变化过程。低浓度乙醇的加入增强了 HSA的α-螺旋结构的稳定性。同时乙醇的加入,促进了分子间β-折叠片结构的形成,削弱HSA的水合作用,最终导致沉淀的发生。最后,对乙醇和等电点pH双重因素对HSA结构和水合作用影响进行了研究,结果表明,两者具有协同作用,加速了 HSA的脱水合过程。本研究从分子光谱的角度,阐明了 HSA醇沉过程的关键分子间相互作用,加深了对醇沉过程HSA的结构变化特征和水合行为变化的理解,为完整阐释HSA的醇沉机制奠定了基础,为血浆蛋白醇沉工艺参数的选择提供了一定的理论基础,为优化生产工艺、获得高品质的血浆蛋白产品提供了关键的科学支撑。同时,通过HSA在不同溶液体系弱相互作用的研究,获得同类体系中作用机理研究的方法,为进一步研究复杂生物体系奠定理论基础。