研究背景新生儿脑出血是早产儿常见的临床问题,重者可导致死亡或遗留严重的后遗症,其中以生发基质-脑室内出血为最常见的类型。生发基质出血(GMH)多发生于未成熟大脑的脑室管膜下或脑室旁生发基质区域,由于该区域紧邻脑室,有时会发展成为脑室内出血(IVH),所以合称为生发基质-脑室出血(GMH-IVH)。该病好发于早产儿,临床表现差异较大,可无临床症状或体征,仅在超声或CT检查时发现;也可出现神志异常或呆滞或激惹,肌张力低下,动作减少,呼吸不规律;严重者出现进行性意识障碍,呼吸困难或暂停、抽搐、瞳孔反射消失,四肢肌张力低下。该病预后不良,出血严重者可导致死亡,将近50%的幸存者会出现脑积水、脑瘫、癫痫、偏瘫、学习障碍等一系列神经功能障碍的后遗症。目前国内外对于GMH-IVH发病机制的研究尚不清楚,未成熟的生发基质在结构上的脆弱性是其易出血的基础,但出血后所致损伤的机制和分子路径仍不明确,研究的热点主要集中在血液成分及代谢产物、小神经胶质细胞与炎症、淋巴细胞与免疫因子等方面。治疗方面,本病的治疗手段有限,以对症治疗为主,一些先进的治疗药物如铁螯合剂、激素类、非甾体消炎药和干细胞治疗都尚在研究中,但并未在临床广泛运用。由于在出血初期缺乏有效的干预,患儿常遗留严重的神经系统损伤。目前尚无中医药在本病的治疗报道,因而本研究拟从中医的角度出发,寻找中医治疗该病的临床方向。研究目的本病由于在出血初期缺乏有效的干预,患儿常遗留严重的神经系统损伤,故本研究通过文献研究,分别从肾论治和从脾论治确定六味地黄汤和四君子汤,运用到动物模型上,观察两者对GMH-IVH的治疗效果并探究其机理,以寻找安全有效的方药、探索中医治疗该病的临床方向。文献研究本病的西医病名是基于现代医学解剖学,且目前尚无中医药治疗的报道,但就疾病本身并非只存在于现代医学,因而我们试图从中医的角度出发,在古籍中搜寻与GMH-IVH相似的中医疾病,整理其病因、病机、临床表现及治法,筛选出与GMH-IVH全貌相符合的疾病,参考其论治从而寻找出治疗GMH-IVH的可能立法方向;再深度剖析GMHIVH的中医病机,明确其病机关键点,结合之前的立法方向,确立从肾论治和从脾论治两大治法并拟定六味地黄汤和四君子汤为主方;将六味地黄汤和四君子汤从方义分析再到方剂在临床相关疾病的运用作详细分析,明确其运用的范围。实验研究健康SPF级7日龄SD大鼠160只,雌雄不限,体重13±2克,随机分为四组:脑出血模型组(简称脑出血组)、六味地黄汤组、四君子汤组、假手术组,每组各40只。脑出血组、六味地黄汤组、四君子汤组大鼠通过向其右侧生发基质层立体定位注射Ⅶ型胶原酶(0.3U)构建GMH-IVH模型后,分别予以生理盐水、六味地黄汤、四君子汤灌胃,每日1次,连续7天。假手术组仅将针尖插入颅内,不注射任何药物,术后给与生理盐水灌胃,每日1次,连续7天。实验一通过短期行为学测试(造模后第1天和第3天)、长期行为学测试(造模后第28天)及头颅影像学(造模后第28天)观察两组药物对GMH-IVH造成的大鼠神经功能障碍和脑室扩张有无改善作用;实验二通过比色法在造模后24小时和72小时检测大鼠脑组织中血红蛋白含量,同时在72小时通过免疫组化法检测活化的小胶质细胞——M2型小胶质细胞数量,以评价干预药物对血肿的吸收和小胶质细胞表型转换有无影响。实验三通过酶联免疫吸附法(ELISA)分别在造模后的24小时、第3天、第7天检测大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α并比较各组之间的差异,以评价干预药物对主要炎症因子的影响。实验结果1.神经功能:六味地黄汤及四君子汤对出血继发的短期神经功能障碍无明显改善作用;六味地黄汤能改善出血继发的长期神经功能障碍(P<0.05),而四君子汤无明显改善作用。2.脑室体积:GMH-IVH会导致出血后28天脑室体积扩张,六味地黄汤可减少因出血造成的脑室扩张体积(P<0.05),而四君子汤组与脑出血模型组比较脑室体积无统计学差异。3.体重:GMH-IVH可引起大鼠在第28天时体重降低,六味地黄汤和四君子汤均可缓解出血继发的体重下降(P<0.05),两组之间相比较无统计学差异。4.血肿的吸收:出血后24小时,六味地黄汤组和四君子汤组与脑出血组模型相比较脑组织中血红蛋白含量均无统计学差异。出血后72小时,六味地黄汤组脑组织血红蛋白含量较脑出血模型组减少(P<0.05),四君子汤组脑组织血红蛋白含量与脑出血模型组比较无统计学差异。5.M2小胶质细胞数量:出血后72小时,免疫组化结果显示,GMH-IVH可诱导小胶质细胞激活和浸润,同时M2型小胶质细胞增多。与脑出血模型组相比较,六味地黄汤组的M2型小胶质细胞增多更明显(P<0.01),而四君子汤组M2型小胶质细胞与脑出血模型组相比无统计学差异。6.IL-1β:GMH-IVH可引起血清IL-1β的表达增高,在出血后24小时,六味地黄汤组和四君子汤组的IL-1β水平与脑出血模型组相比无统计学差异。但在出血后3天和出血后7天,六味地黄汤能显著降低该炎症因子的水平(P<0.05),而四君子汤组的IL-1β水平与脑出血模型组相比无统计学差异。7.IL-6:GMH-IVH可引起血清IL-6的表达增高,在出血后24小时,六味地黄汤组和四君子汤组的IL-6水平与脑出血模型组相比无统计学差异。但在出血后3天和出血后7天,六味地黄汤能显著降低该炎症因子的水平(P<0.05),而四君子汤组的IL-6水平与脑出血模型组相比无统计学差异。8.TNF-α:GMH-IVH可引起血清TNF-α的表达增高,在出血后24小时,六味地黄汤组和四君子汤组的TNF-α水平与脑出血模型组相比无统计学差异。但在出血后3天和出血后7天,六味地黄汤能显著降低该炎症因子的水平(P<0.05),而四君子汤组的TNF-α水平与脑出血模型组相比无统计学差异。研究结论1.六味地黄汤可改善GMH-IVH引起的长期神经功能障碍、减轻脑室扩张,而对短期神经功能障碍无改善作用。2.六味地黄汤改善长期神经功能障碍的可能作用机制是:通过增加M2型小胶质细胞的数量从而促进GMH-IVH后血肿的吸收,并降低由出血导致的促炎症因子如IL-1β、IL-6和TNF-α的增高,从而减轻继发性脑损伤。3.从长期来看,六味地黄汤和四君子汤均能改善由于GMH-IVH导致的大鼠体重降低。4.六味地黄汤在改善长期神经功能障碍、减轻脑室扩张方面显示出治疗效果,在一定程度上说明“从肾论治GMH-IVH”是可行的。