多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是世界上最早认识的一类致畸、致癌和致突变化合物,具有难降解、半衰期长、易在土壤、沉积物、水体等环境介质中累积且毒性较强,并可通过食物链的传递对生态环境和人体健康造成极大的危害。微生物降解是去除土壤PAHs污染的最主要途径,细菌则是其中参与PAHs降解较为活跃的一类微生物。本研究分离获得两株菲(Phenanthrene,PHE)高效降解菌株Massiliasp.WG5和WX5,选择以致癌PAHs的模式化合物PHE为目标污染物,研究Massiliaspp.对菲的降解途径、分子机制及修复应用,取得的主要研究结果如下:(1)16SrRNA基因PCR扩增测序结果发现,WG5和WX5两株菌的16SrRNA基因序列完全一致,鉴定为变形菌门(Proteobacteria)下的Massiliasp.。而且,两株菌生理生化上仅在LB液体培养条件下存在明显肉眼可见的区别,培养后期WG5菌株呈现浑浊而WX5菌株呈现絮状沉淀。完成这两株菌的全基因组测序后,分析发现两个菌株的全基因组相似度高,序列相似度高达99.37%,而基因组保守性距离也仅有0.0033。两个基因组的主要区别在于WG5染色体基因组含有一个WX5基因组所没有的插入片段,而该插入片段上存在一个预测出来的MspWG5Ⅱ甲基化修饰酶基因。该基因氨基酸序列长度约为883aa,以CAAGAC六个碱基为识别序列且全基因组的检出率高达100.00%,推测正是由于这个甲基化酶基因的存在改变了 WG5菌株在LB液体培养基中的表型。(2)WG5和WX5菌株对PHE都有较高效的降解能力,能在48hr内完全降解100 mgL-1的PHE。两者相比较,WX5降解能力稍高一点,在5天内可完全降解400 mgL-1的PHE,而WG5只能降解80%左右。在测定降解产物的过程中,分离并获得一种玫红色的中间代谢产物,该产物不溶解于H2O、HCl、乙酸乙酯、甲醇、二甲基亚砜、正己烷、丙酮、氯仿等不同极性溶剂,使用紫外-可见光光谱、HPLC-UV/FLD和傅里叶红外光谱扫描分析等技术并未能解析出该物质结构。此外,通过甲基化衍生化和GC-MS测定出反式间位羟基苯亚甲基丙酮酸和邻苯二甲酸。基因组降解功能基因分析推测出35个降解基因,结合GC-MS测定结果推测出三条代谢通路。一条经过邻苯二甲酸,一条经过水杨酸,还有一条从1-羟基-2-萘甲酸转化为反式-2-羧基肉桂酸的代谢途径。(3)通过WG5菌株的转录组RNA-Seq测序和分析,结合GO、KEGG注释和COG分类等数据库并未发现有与PHE降解有关的差异表达基因。将差异表达基因匹配到先前推测的降解通路,并未检测到邻苯二甲酸通路中邻苯二甲酸下游的基因有差异表达。该结果表明WG5降解菲有可能是途径邻苯二甲酸代谢通路,但邻苯二甲酸是代谢终产物;而另一途径反式-2-羧基肉桂酸的代谢通路可能起更重要的作用。同时,发现了一串差异表达但未能匹配到推测的代谢通路的基因簇,这些基因并未能在数据库中匹配出明确的蛋白功能。通过氨基酸序列blast建树后,发现与数据库中已有序列的相似度较低,推测出这些基因可能是一条新的降解途径。(4)WG5菌株在土壤PHE污染(50 mg kg-1)中也有较好的修复能力,在添加WG5处理中土壤PHE含量的下降非常快速,培养3天后土壤中PHE的含量仅剩9.06 mg kg-1。通过将qPCR和高通量测序结果相结合,利用EDL993作为验证菌株,建立iHAAQ高通量绝对定量方法,并发现添加WG5的处理中马赛菌属(Massilia)绝对含量随着土壤PHE含量的降低而增加,证明了 WG5菌株决定了土壤PHE的快速降解。同时,热图和PCA分析表明,WG5菌株仅在土壤PHE可利用时的增殖影响了土壤细菌的群落结构,而随着土壤中PHE的浓度和生物有效性降低,细菌群落结构可以恢复并接近最初状态。因此,WG5菌株是修复土壤PHE污染高效且环境友好的生物修复材料。