肺癌是危害人类健康的重大疾病之一。《2012中国肿瘤登记年报》显示肺癌居我国恶性肿瘤发病率和病死率首位,其中约85%为非小细胞肺癌。尽管近年来肺癌的诊断和治疗不断发展,新的诊断方法不断被采用,手术方案不断革新,化疗方案及新的化疗药物不断研发,新的治疗方案(如分子靶向治疗等)不断应用于临床,但是其5年生存率仍较低,不足17%。由于大部分肺癌发现时已为晚期,失去手术时机,此时含铂——尤其是顺铂的联合化疗,是一线推荐的标准抗肿瘤治疗方案。但是由于肺癌对顺铂的天然耐药或继发性耐药进一步限制了化疗的临床疗效。因此阐明肺癌化疗耐药的机制、找到有效克服化疗耐药的药物、寻找新的有效地抗肿瘤治疗方案,已成为肺癌临床治疗中亟待解决的问题。RBM5(又称为Luca15或H37)基因是近年来发现的抑癌基因,定位于染色体3p21.3区域。RBM5可以调控多种基因m RNA前体的选择性剪切,从而调节基因的表达,调节细胞内信号通路和细胞的生物学行为。RBM5与肺癌的发生、发展密切相关。在肺癌组织中其表达量明显低于正常肺组织。外源性高表达RBM5可以抑制肺癌、乳腺癌、纤维肉瘤、前列腺癌等多种肿瘤细胞的增殖,也可以逆转肺腺癌细胞的顺铂耐药。现有研究表明RBM5作用机制主要是通过调节线粒体凋亡途径、Bcl-2家族表达、EGFR及细胞周期蛋白表达,从而促进肿瘤细胞凋亡和细胞周期抑制来起到抗肿瘤作用。但有关RBM5抗肿瘤、逆转顺铂耐药的具体机制仍未完全明确。自噬是一种在所有真核细胞中存在的进化保守的生物学行为。它的作用主要是去除过剩的或损伤的细胞器或分子,及在应激状态下进行胞浆的回收利用,以提供能量及为生命大分子合成提供原料,从而维持细胞内环境稳定。自噬失调与多种疾病相关,其中也包括肿瘤。近年来越来越多的证据表明自噬在肿瘤细胞放化疗耐受过程中起到了重要的作用。有研究表明自噬在肺癌细胞获得性顺铂耐药过程中起到了重要作用,但是在肺癌细胞中自噬的调节机制仍未完全明确。有研究表明EGFR及Bcl-2家族成员通过与自噬核心调节因子Beclin1相互作用而起到调控自噬的作用。而EGFR及Bcl-2表达均受RBM5调控,因此本研究旨在探讨在肺腺癌细胞中RBM5是否对自噬起到调控作用,同时明确自噬在RBM5抗肿瘤、逆转顺铂耐药中起到的作用。本研究以人肺腺癌细胞A549及其顺铂耐药细胞株A549/DDP为研究对象,探讨肺腺癌细胞中RBM5在调控自噬相关基因表达、调控自噬水平及调节对顺铂的敏感性中所起的作用。本研究将明确RBM5抗肿瘤/逆转顺铂耐药机制及细胞内自噬的调控机制,为肺癌治疗方案的发展提供科学依据。方法:1)MTT法检测人肺腺癌A549细胞及其顺铂耐药株A549/DDP细胞的顺铂敏感性,相差显微镜观察细胞形态。2)吖啶橙染色、MDC染色、透射电镜从形态学上检测A549及A549/DDP细胞中自噬囊泡的生成。Western blot方法检测自噬相关蛋白LC3-I/II、Beclin1、Lamp1表达水平。3)脂质体法瞬时转染RBM5表达质粒(GV287-RBM5)至A549细胞,或在过表达RBM5同时加入自噬抑制剂3-MA,RT-PCR及Western blot方法检测RBM5 m RNA及蛋白表达水平,吖啶橙染色、MDC染色、透射电镜及Western blot方法检测细胞自噬水平。MTT法检测细胞的生存率。Western blot方法检测自噬调控蛋白Beclin1、Bcl-2和NF-κB/P65的表达水平。4)建立A549细胞裸鼠皮下移植瘤模型,应用携带GV287-RBM5质粒的减毒沙门氏菌作用于移植瘤引起RBM5高表达,免疫组化法检测肿瘤组织中RBM5、LC3,LAMP1和Beclin1的表达水平。5)脂质体法瞬时转染GV287-RBM5至A549/DDP细胞,或在过表达RBM5同时加入自噬抑制剂3-MA,RT-PCR及Western blot方法检测RBM5的表达水平,吖啶橙染色、MDC染色、透射电镜及Western blot方法检测细胞自噬水平。MTT法检测细胞的生存率。结果:1)A549/DDP细胞对顺铂的敏感性明显低于A549细胞。与A549细胞相比,A549/DDP细胞体积增大,形态更不规则。2)吖啶橙染色、MDC染色、透射电镜检测结果显示A549/DDP细胞中自噬囊泡的生成明显多于A549细胞。Western blot方法检测结果显示A549/DDP细胞中自噬相关蛋白LC3-I/II、Beclin1、Lamp1表达水平明显高于A549细胞。3)RT-PCR及Western blot方法证实转染GV287-RBM5的A549细胞RBM5高表达。吖啶橙染色、MDC染色、透射电镜及Western blot方法检测结果显示过表达RBM5的A549细胞自噬水平较对照组增高,加入3-MA后RBM5诱导的细胞自噬受到抑制,早期凋亡细胞增加。MTT法检测结果显示RBM5过表达可抑制A549细胞增殖,而联合应用3-MA后可进一步加强RBM5过表达引起的细胞增殖抑制和化疗增敏作用。Western blot检测结果显示RBM5过表达可上调Beclin1、NF-κB/P65表达水平和下调Bcl-2的表达水平,而加入3-MA后这一作用受到抑制。4)成功建立A549细胞移植瘤动物模型。在移植瘤组织中过表达的RBM5增强了LC3、LAMP1和Beclin1的表达。5)转染后A549/DDP细胞中RBM5表达上调。过表达RBM5的A549/DDP细胞自噬水平较对照组增高,加入3-MA后RBM5诱导的细胞自噬受到抑制,早期凋亡细胞增加。RBM5过表达可抑制A549/DDP细胞增殖,而联合应用3-MA后可进一步加强RBM5过表达引起的细胞增殖抑制和化疗增敏作用。结论:1)过表达RBM5可诱导非耐药/耐药肺腺癌细胞自噬增强,这种自噬可能起到细胞保护作用,拮抗了RBM5的抗肿瘤作用。RBM5对Beclin1、Bcl-2和NF-κB/P65基因表达的调控可能是其机制之一。2)自噬抑制剂3-MA可有效拮抗RBM5诱导的自噬,并增强RBM5过表达介导的凋亡作用、抗肿瘤作用和化疗增敏作用。因此自噬抑制剂联合RBM5过表达治疗可能是治疗肺腺癌和逆转化疗耐药的有效途径。