禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)是一类能导致禽类多种肿瘤及免疫抑制性疾病的反转录病毒。根据其表面囊膜蛋白特性,ALV可以分为A～K共11个亚群,感染鸡的主要包括A、B、C、D、E、J及K亚群;E内源性ALV,而其它均为外源性ALV。其中,ALV-K是近年在国内地方品系鸡中分离鉴定出的新型禽白血病病毒。值得注意的是,由于ALV-K复制能力较弱,目前ALV净化检测技术对ALV-K的检测效果不理想,往往出现假阴性。另外,与不同ALV亚群比较,研究发现ALV-K的囊膜蛋白与ALV-A的同源性较高,且发现两者具有共同细胞受体。为创制ALV-K特异灵敏诊断技术用于ALV高效净化,本研究在分离到一株ALV-K病毒基础上,对ALV-K及ALV-A分别制备了相应的定性标准抗原及定性标准阳性血清,并进行了标定。1一株K亚群禽白血病病毒分离鉴定及其全基因组测定分析本研究对广东某养殖场内疑似感染禽白血病病毒的鸡群进行了病毒分离与鉴定。病料通过接种DF-1细胞及PCR扩增,分离及鉴定到一株K亚群禽白血病病毒,命名为GD180913。全基因测定及分析发现GD180913分离株基因组全长为7483bp,与ALV-K参考毒株的同源性高达98.8%。编码的3个主要基因gag、pol及env大小分别为2103bp、2688bp及1806bp,长末端重复序列大小为274bp。gp85氨基酸序列进一步比较表明,GD180913分离株的gp85与ALV-A、ALV-B、ALV-C、ALV-D、ALV-E及ALV-J参考株同源性仅为38.9%-83.9%,而与ALV-K参考株同源性高达99.1%。ALV-K毒株GD180913的成功分离鉴定为进一步制备ALV-K定性标准抗原及定性标准阳性血清提供了材料,打下了基础。2 A/K亚群禽白血病抗原定性标准样品的制备为获得ALV-A以及ALV-K抗原定性标准样品,本研究通过PCR、IFA及ELISA鉴定ALV-A毒株AH10以及ALV-K毒株GD180913基础上,在DF-1细胞对AH10及GD180913毒株进行了大量病毒扩增,并进行了病毒纯粹性、病毒滴度、均一性、稳定性以及保存时间等标定。结果发现:扩增的AH10及GD180913毒株中均不存在所检测的新城疫病毒NDV、禽流感病毒AIV、鸡减蛋综合征病毒EDS76、小鹅瘟病毒GPV、鸡马立克病毒MDV、鸡传染性支气管炎病毒IBV、禽网状内皮增生症病毒REV、鸡传染性贫血病病毒CAV、鸡传染性喉气管炎病毒ILTV、J亚群禽白血病病毒ALV-J、细菌及支原体等污染;AH10及GD180913 病毒滴度分别为 104.63TCID50/100μL 及 104.25 TCID50/100μL;扩增的 AH10 及GD180913病毒具有良好的均一性及稳定性。A/K亚群禽白血病抗原定性标准样品获得及其标定,可为今后ALV-A及ALV-K诊断提供标准抗原。3 A/K亚群禽白血病阳性血清定性标准样品的制备为制备抗ALV-A及ALV-K病毒阳性血清定性标准样品,本研究将鉴定过的纯净的ALV-A毒株AH10以及ALV-K毒株GD180913通过肌肉注射接种方式对SPF鸡进行了感染免疫,每隔10天加强免疫1次,分别在4免及5免后采血分离血清。通过IFA及ELISA对获得的血清的特异性、抗体效价、纯净性、均一性、稳定性以及保存时间等进行了标定。结果发现:所制备的抗ALV-A及ALV-K阳性血清具有良好的特异性,与所检测的NDV、AIV、EDS-76、GPV、REV、MDV、IBV 及 ALV-J 不反应;ELISA 效价分别为 1:2000及1:500;IFA效价分别为1:200及1:100;血清中不存在细菌及支原体污染;具有良好的均一性及稳定性。A/K亚群禽白血病阳性血清定性标准样品的获得及其标定,可为今后ALV-A及ALV-K诊断提供标准血清。