硫熏法是一种传统的中药材产地加工方法,利用硫磺燃烧后生成二氧化硫,以达到杀菌防虫、防霉,利于药材的储存养护,并使药材美观增色的目的。由于中药材经硫熏后,其外观、化学成分和药理作用等多会发生变化,且中药材经硫熏后的主要残留物亚硫酸盐对机体神经系统、消化系统和呼吸系统等均有毒性作用,2004年国家食品药品监督管理局(SFDA)在《关于对中药材采用硫磺熏蒸问题的函复》中规定：市场流通领域的中药材及其饮片,通过采用硫磺熏蒸或浸泡达到外观漂白的行为,应按违反《药品管理法》第49和75条的规定(即劣药)进行查处；《中国药典》2005年版一部则已删除葛根、山药等在产地加工时硫熏的规定；2011年6月,国家药典委员会发布了“关于在中药材及饮片中控制S02残留量检测限度的公示”(以下简称限度标准),规定山药、牛膝、粉葛等11种中药材的SO：残留量不得超过400μg·g-1,其他中药材及饮片则低于150μg·g-1。但在经济利益的驱使下,硫熏中药材在市场流通领域仍普遍存在。本文根据亚硫酸钠、邻苯二甲醛和乙酸铵反应呈紫色,建立显色反应对中药材二氧化硫残留进行快速定性,并可初步半定量的检测方法；基于亚硫酸盐一邻苯二甲醛-铵盐反应生成荧光化合物的原理,首次建立荧光衍生法测定中药材的二氧化硫残留量；同时根据以碱性溶液提取样品,可将药材中可逆结合态的亚硫酸盐释放出来的原理,首次建立碱性溶液振荡提取法用于测定过程中样品的前处理；采用已建立的方法对市购的山药、葛根、黄芪、党参、当归、菊花和薏苡仁等药材的二氧化硫残留量进行检测,操作简便、快速,灵敏度较高;编制中药材二氧化硫残留量检测技术标准草案,为硫熏中药材的质量控制升级提供了有力参考。主要研究内容及结果如下：1.中药材二氧化硫残留的快速检测方法研究根据亚硫酸钠、邻苯二甲醛和乙酸铵反应呈紫色,且颜色强度与亚硫酸钠的量成正比关系,建立了显色反应对中药材二氧化硫残留快速定性的方法。采用分光测色分析溶液颜色色度,结果亚硫酸钠加入量与溶液颜色色度在0～25.23μg范围内线性关系良好,可作为中药材二氧化硫残留的初步定量方法。利用本法对市购的山药、葛根、黄芪、党参和薏苡仁的部分样品共20批次进行检测,结果测定的20批次不同样品均检出二氧化硫残留,根据其定量结果,与限度标准进行比较,18批药材的二氧化硫残留量超过规定限量,提示硫熏中药材的情况目前仍普遍存在。本法操作简便、快速,灵敏度较高,可为中药材二氧化硫的快速定性检测提供参考。2.二氧化硫残留量的测定方法研究2.1荧光衍生法的建立2.1.1荧光衍生条件的研究中药材的二氧化硫残留主要以游离态和结合态的形式存在,游离态包括亚硫酸氢盐(HSO3-)、SO2分子和亚硫酸盐(S032-),并极易与药材中的还原糖、蛋白质、色素、酶、维生素、醛、酮等形成各种形式的结合态二氧化硫残留。由于不可逆结合的亚硫酸盐在生理环境下不发生解离,不会对人体健康发生危害,故一般二氧化硫或亚硫酸盐的检测对象是游离的亚硫酸根及可逆结合的亚硫酸盐。《中国药典》2010年版一部虽在附录增加二氧化硫残留量测定法,但检测装置复杂,需特制的全玻璃蒸馏装置,且操作过程繁琐,碘滴定液使用前须三氧化二砷标定,不利于方法的推广；文献报道测定中药材二氧化硫残留量的方法主要有盐酸副玫瑰苯胺法、离子色谱法、高效液相色谱法和气相色谱法等,但盐酸副玫瑰苯胺法需使用有毒的四氯汞钠吸收液,而色谱法则会增加检测成本。基于亚硫酸盐-邻苯二甲醛-铵盐反应生成荧光化合物的原理,首次建立了荧光衍生法测定中药材的二氧化硫残留量。通过对影响荧光衍生化反应的因素包括pH、衍生试剂用量、反应温度和时间等进行单因素考察,确定荧光衍生的最佳条件。该法具有灵敏度高、操作简便、快速准确等特点,可为中药材二氧化硫残留量的测定方法提供借鉴。2.1.2样品前处理方法研究《中国药典》2010年版一部规定使用酸蒸馏法对样品进行前处理,需特制的全玻璃蒸馏装置,操作过程繁琐,且可逆结合的亚硫酸盐在酸性条件下稳定,在pH>7时则分离成亚硫酸根(H2SO3(？)H’+HSO3-,HSO3-(?)H++SO32-)。本文对二氧化硫残留量测定时供试品溶液的制备方法进行了研究。以碱性溶液对样品进行前处理,可释放出药材中可逆结合的亚硫酸盐,同时采用振荡提取法,自动化程度高,能大大缩短提取时间,适用于大批量样品的处理。本文首次建立了碱性溶液振荡提取法对样品进行前处理,可为中药材二氧化硫残留量测定过程中样品的前处理过程提供参考。2.2中药材二氧化硫残留量的测定2.2.1荧光衍生分析方法的验证本文以未经硫磺熏蒸处理的山药样品(阴性对照)为研究对象,分别硫熏30、60、90、120和150min,以碱性溶液振荡提取法对样品进行前处理,采用荧光衍生法测定阴性对照样品和不同硫熏时间样品的二氧化硫残留量,结果未经硫熏的山药二氧化硫残留量为0,而硫熏山药样品均检出二氧化硫残留,且二氧化硫残留量随硫熏时间的增加而增大。表明利用荧光衍生法测定中药材二氧化硫残留量具有可行性。2.2.2本方法与药典方法的比较以碱性溶液振荡提取法对山药、党参、当归和薏苡仁共4批样品进行前处理,采用荧光衍生法测定其二氧化硫残留量,与《中国药典》2010年版一部收载的二氧化硫残留量测定法比较,结果采用本文所建方法测定的二氧化硫残留量比药典方法高约10倍,推测与样品前处理过程中,本文采用碱性溶液可提取出样品中可逆结合态的亚硫酸盐,而药典方法采用酸性溶液仅能提取出游离态的亚硫酸盐,因此本法的测定结果更能接近药材的实际二氧化硫残留量。2.2.3样品测定利用本法对市购的山药、葛根、黄芪、党参、当归、薏苡仁和菊花等88批次药材的二氧化硫残留量进行测定,与限度标准对比,结果仅约22%的样品二氧化硫残留量符合限量要求,表明硫磺熏蒸中药材的情况目前仍普遍存在。3.中药材二氧化硫残留量检测技术标准草案的编制通过对荧光衍生法测定中药材二氧化硫残留量进行系统研究,编制了荧光衍生法测定中药材二氧化硫残留量的检测技术标准草案,可为硫熏中药材的质量控制提供科学依据,为国家标准的制定提供参考。