仔猪腹泻是规模化猪场常见的疾病之一,传染性强且病情反复较难根治,给国内外养猪业造成巨大的经济损失。产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）是造成该病的主要病原,它能够产生肠毒素和黏附素,在仔猪肠道上皮细胞定居并大量繁殖,造成仔猪腹泻脱水甚至死亡。有关该菌的生物学特性、致病因子、感染机理、新兴疫苗研发等各方面的研究都离不开一个好的实验动物模型,综合考虑其疾病相似性、重复性及经济性,目前仍没有建立起合适的ETEC感染的实验动物模型。目前防治该病的有效方法就是接种疫苗,而传统疫苗存在地域使用限制、安全性不高、免疫效果不理想等问题。本研究建立了 ETEC感染5周龄仔兔的腹泻动物模型,从临床症状、病理变化、细胞因子水平等方面评价其作为动物模型的适用性;用Red同源重组法对编码肠毒素和黏附素的基因进行敲除,并用基因敲除后的菌株制成基因缺失灭活疫苗,研究其对仔兔的免疫保护效果,拟为深入研究ETEC菌株和防控规模化猪场仔猪腹泻疾病提供有效的试验依据。1产肠毒素大肠杆菌腹泻动物模型的建立本研究尝试用小鼠做腹泻模型,设置四个浓度梯度对ICR、BALB/c、C57/BL6j三种品系小鼠进行灌胃处理,结果发现高剂量组小鼠死亡,低剂量组小鼠有精神萎靡、被毛杂乱、饮水摄食减少等临床表现,虽然在病理解剖和病理切片均能观察到一定病理变化,但所有组别均未出现腹泻的典型症状,表明小鼠不适合作为ETEC的动物模型;而后试验改用仔兔做动物模型,结果发现,用ETEC感染5周龄仔兔,当口服灌胃剂量为1×107CFU时能够造成仔兔腹泻,腹泻率为73.3%;腹泻仔兔精神状态差,体重减轻、饮水摄食量减少,腹泻粪便带毒,阳性检出率为87.8%;对腹泻仔兔进行病理解剖发现小肠壁极薄易碎、呈透明状,肠壁有出血点,盲肠肿大,病理损伤严重;病理切片提示胃绒毛的断裂,黏膜坏死脱落,空回肠绒毛断裂较为严重,腺体排列紊乱;血细胞分析结果表明白细胞和红细胞总数降低,严重感染时,腹泻伴随白细胞代偿不足,引起败血症,导致白细胞、红细胞数目下降;ELISA试剂盒检测兔血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6水平,结果显示,腹泻组的三个促炎细胞因子水平与空白对照组相比均显著升高,浓度差异有统计学意义（P<0.0001、P<0.01、P<0.0001）,这表明ETEC菌株导致腹泻并能够引起兔血清中细胞炎性因子分泌水平的变化。对比小鼠与仔兔的试验结果,小鼠无法产生典型的腹泻症状,而仔兔腹泻动物模型在感染途径、临床表现和病理变化上均与仔猪腹泻症状相似,模型的重复性较好,且5周龄仔兔体型小、饲养管理及试验操作方便,是研究猪源ETEC良好的动物模型,可以作为研究其致病机理和新疫苗研制的动物模型使用。2产肠毒素大肠杆菌faeG/stb/LT三基因缺失株的构建及毒力测定用Red同源重组法对编码热稳定性肠毒素基因STb的部分序列stb、编码热不稳定性肠毒素LT的基因LT和编码黏附素K88主要亚基FaeG的基因faeG进行基因敲除,构建了三基因缺失株CVCC196ΔfaeGΔstbΔLT,并对缺失株的毒力进行测定,仔兔致腹泻试验结果显示,野生株致仔兔腹泻率为73.3%,三基因缺失株对仔兔的腹泻率为26.7%,腹泻率下降了 46.7%,差异极显著（P<0.01）,缺失毒力基因后,菌株的致病力明显下降。3基因缺失灭活疫苗的制备及对仔兔的免疫效果评估由于基因缺失株仍然能导致仔兔腹泻,所以我们放弃了弱毒苗的研制而改为研制灭活苗。用缺失了三种毒力基因faeG、stb、LT的三基因缺失株作为免疫原,与佐剂ISA206 1:1混合制成基因缺失灭活苗,以免疫A组（2×108CFU/mL）,免疫B组（5×108CFU/mL）和免疫C组（1×109CFU/mL）不同免疫剂量分别颈部皮下多点注射免疫仔兔,每只接种量2mL,首次免疫两周后二免,二免一周后三免,三免一周后攻毒,试验结果显示,不同剂量组的基因缺失灭活苗对仔兔的腹泻保护率均能达到100%。对免疫前后不同时间点仔兔血清中的IgG抗体效价进行测定,结果表明一免二免后的抗体效价差异不大,各剂量组之间的差异也不明显,而三免后产生的抗体效价极显著高于二免后产生的抗体效价（P<0.01）,三免后抗体效价最高达到1:409600,最低可达到1:25600,说明疫苗可以在体内产生足够的抗体,能对ETEC的感染起到较好的保护作用。