第一部分养阴清热化瘀方同步胸部放疗调节Th1/Th2免疫失衡及对放射性肺炎的临床研究目的探讨养阴清热化瘀方同步胸部肿瘤放疗对Th1/Th2免疫平衡的影响及放射性肺炎临床疗效研究。方法将2014年07月~2016年07月间放化疗住院的胸部放疗患者136例,采用分层数字表法随机分为养阴清热化瘀方治疗组67例和对照组69例,治疗组:放疗或同步放化疗基础上给予养阴清热化瘀方,每日一剂,常规水煎2次,取药液200ml,分2次口服,从放疗开始,直到放疗结束1个月。对照组:单纯放疗或同步放化疗。于放疗开始前、放疗中和放疗后取空腹静脉血3ml,用ELISA法测定血清中IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6含量,采用RTOG急性放射性肺炎标准评价急性放射性肺炎发生率及中医临床症状评分表(自拟)评价患者生活质量及临床症状。结果治疗组急性放射性肺炎发生率为13.43%(9/67),对照组为28.98%(20/69),两组比较统计学有差异(P<0.05)。治疗组放疗中、后IFN-γ、TNF-α变化不明显,但对照组IFN-γ、TNF-α均明显升高,经比较有统计学差异(P<0.01)。治疗组放疗中、后IL-4、IL-6呈现下降趋势,但对照组IL-4呈现下降趋势,IL-6呈现上升趋势,经比较两组有统计学差异(P<0.01)。对照组在放疗中及放疗后IFN-γ/IL-4比值有显著性变化,经与治疗组比较有统计学意义(P<0.01)。放疗后治疗组中医临床症状评分明显降低,治疗组评分改善程度明显优于对照组,与对照组对比,两组有统计学意义(P<0.05)。结论养阴清热化瘀方可降低放射性肺炎的发生率,可能通过调节Th1和Th2类细胞因子的表达来调整Th1/Th2免疫平衡,改善放射性肺损伤的免疫失衡状态。第二部分养阴清热化瘀方对放射性肺损伤防护作用的基础研究实验一养阴清热化瘀方对放射性肺损伤大鼠肺泡灌洗液细胞计数、肺组织病理形态的影响目的通过建立可靠及稳定的大鼠放射性肺损伤动物模型,并对模型进行有效评价,初步探讨养阴清热化瘀方对大鼠放射性肺损伤的防护作用。方法采用随机数字表法将162只雌性Wistar大鼠随机分为6组,Control组、Model组、Decoction组、Intervention组、PDTC组、Prednisone组,除空白对照组外,其他5组均以6MV X射线右肺单次20Gy照射制作大鼠放射性肺损伤模型。照射后观察大鼠一般情况,并于第1、4、8和12周处死大鼠观察肺病理切片,计算肺系数,计数支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数。结果(1)一般情况:Control组大鼠皮毛、行动、反应、食量等情况都较正常,在观察时间里无大鼠死亡;Model组大鼠自第2周开始,出现精神不振、食量减少、弓背卷缩、皮毛倒翻、被毛渐渐枯槁无光泽,反应稍迟钝,自第8周开始,部分大鼠毛色晦暗无光泽,出现明显呼吸急促、行动迟缓,且体重缓慢上升,观察期间共死亡4只大鼠;Decoction组、Intervention组和Prednisone组在第3周左右开始有少部分大鼠出现食量下降、动作迟缓、弓背卷缩、毛色稀疏情况,自第7周食量、毛色、行动等均有不同程度的改善,Decoction组、Intervention组在第5周各有1只大鼠死亡;Prednisone组在第6周、12周各有1只大鼠死亡;PDTC组大鼠精神状态、毛色、食量等均较中药组和激素组弱,在第1周死亡大鼠1只,第6周死亡大鼠2只。(2)肺系数:与Control组比较,Model组在1、4、8、12周大鼠肺系数明显升高(p<0.01);与Model组比较,Decoction组、Intervention组、PDTC组、Prednisone组在1、4、8、12周大鼠肺系数均有不同程度降低(P<0.05);与Prednisone组,Decoction组、Intervention组大鼠肺系数在1、4、8周降低程度相当(p>0.05);Decoction组、Intervention组在第12周大鼠肺系数低于Prednisone组(P<0.05)。PDTC组大鼠肺系数大于Decoction组、Intervention组及Prednisone组,在第8周、12周更显著(P<0.05)。(3)病理形态学:与Control组比较,Model组照射后第1周大鼠肺组织中可见少量炎症细胞浸润;第4周可见明显水肿及支气管周围炎性细胞浸润,肺泡结构破坏,部分肺泡萎缩;第8周大鼠炎性细胞减少,部分肺泡塌陷、不张,肺泡间隔增宽,被破坏,并少许梭形成纤维细胞形成;第12周大鼠肺泡扩张,肺泡塌陷更显著、并纤维化。随着时间延长,Decoction组、Intervention组肺泡炎及肺纤维化程度明显较Model组轻;Decoction组、Intervention组在第8周、12周肺泡萎缩、壁内成纤维细胞均较Prednisone组不同程度减轻。Decoction组在第1周、第4周大鼠肺组织病理变化程度与Intervention组无明显差别;第8周炎性细胞浸润程度稍重于Intervention组。(4)BALF计数:Model组与Control组比较,各时间点肺泡灌洗液细胞总数均明显升高,以第4、8、12周升高显著(p<0.01);Decoction组、Intervention组、Prednisone组、PDTC组各时间点肺泡灌洗液细胞总数也有所升高,与同时间点Model组比较降低(P<0.05),PDTC组降低最为明显(P<0.01)。Decoction组、Intervention组与Prednisone组比较,在第1、8、12周细胞总数有明显差别(p>0.05);Decoction组与Intervention组在各观察时间点比较,细胞总数无明显差别(p>0.05)。结论应用6MV X射线单次20Gy照射大鼠右肺,可以成功构建大鼠放射性肺损伤模型,且大鼠肺组织病理改变历经急性炎症期、增生期、纤维化期三个过程,为今后研究药物防治放射性肺损伤的作用机制及防治药物的筛选提供了实验基础。养阴清热化瘀方可减轻放射性肺损伤病理改变,推迟放射性肺损伤病理发生过程,而且该方可改善大鼠一般情况,包括食量、毛色、活动及体重等,但养阴清热化瘀方提前1周干预在病理学形态改变并未优于养阴清热化瘀方同步干预。实验二养阴清热化瘀方对放射性肺损伤大鼠血清及肺组织Th1/Th2的影响目的研究养阴清热化瘀方对放射性肺损伤大鼠Th1/Th2失衡的免疫调节作用。方法采用随机数字表法将162只雌性Wistar大鼠随机分为6组,Control组、Model组、Decoction组、Intervention组、PDTC组、Prednisone组,除空白对照组外,其他5组均以6MV X射线右肺单次20Gy照射制作大鼠放射性肺损伤模型。在第1、4、8、12周处死大鼠,用ELISA法检测大鼠血清Th1细胞因子TNF-α、IL-1α和Th2细胞因子IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β水平;用RT-PCR法检测大鼠肺组织Th1细胞因子TNF-α、IL-1α和Th2细胞因子IL-4、IL-6、IL-10、TGF-βmRNA表达。结果(1)大鼠血清Th1/Th2细胞因子变化:与Control组比较,各照射组大鼠血清TNF-α、IL-1α、IL-6、TGF-β水平第1、4、8、12周明显升高(P<0.01);血清IL-4水平第1、4周未见明显变化(P>0.05),第8、12周明显升高(P<0.01);血清IL-10水平第1、4周明显降低(P<0.01),在第8、12周逐渐升高(P<0.01)。与Model组比较,Decoction组和Intervention组第1、4、8、12周大鼠血清TNF-α、IL-1α、TGF-β水平明显低于Model组(P<0.05);Decoction组第1周血清IL-6水平变化差异无统计学意义(P>0.05),第4、8、12周血清IL-6水平明显低于Model组(P<0.01);Intervention组血清IL-6水平第1、4、8、12周明显低于Model组(P<0.01);Decoction组、Intervention组与Model组比较血清IL-4水平第1、4周未见明显变化(P>0.05),第8、12周明显低于Model组(P<0.01);Decoction组和Intervention组第1、4周血清IL-10水平明显高于Model组(P<0.05),在第8、12周血清IL-10水平明显低于Model组(P<0.01)。与Decoction组比较,Intervention组大鼠血清TNF-α、IL-1α、IL-6、TGF-β、IL-4水平第1、4、8、12周未明显降低(P>0.05);大鼠血清IL-10水平第1周明显高于Decoction组(P<0.05),第4、8、12周无显著性差异(P>0.05)。与Prednisone组比较,Decoction组和Intervention组大鼠血清TNF-α、IL-1α、TGF-β水平第1、4周无明显差异(P>0.05),第8、12周低于Prednisone组(P<0.05);血清IL-6水平第1、4、8周无明显差异(P>0.05),第12周明显低于Prednisone组(P<0.05);大鼠血清IL-10水平第1、4、8、12周均高于Prednisone组,但仅在第8周有显著性差异(P<0.05)。(2)大鼠肺组织Th1/Th2细胞因子蛋白表达:与Control组比较,Model组TNF-α、IL-1α、IL-6 mRNA表达量在第1、4、8、12周明显高于Control组(P<0.01),且在第8周达到峰值;Model组TGF-βmRNA表达量在第1、4、8、12周明显高于Control组(P<0.01),且随时间延长逐渐升高;Model组IL-4 mRNA表达量第1周、第4周较Control组稍有升高(P>0.05),在第8周、12周明显升高(P<0.01);Model组IL-10 mRNA表达量从第1周开始下降,在第4周下降至最低值,第8周开始逐渐升高,与Control组比较有统计学意义(P<0.01)。与Model组比较,Decoction组和Intervention组TNF-α、IL-1α、IL-6 mRNA、TGF-βmRNA表达量在第1、4、8、12周明显低于Model组(P<0.05);Decoction组和Intervention组IL-4、IL-10 mRNA表达量在第1周、第4周均显著高于模型组(P<0.05),在第8周、第12周显著低于模型组(P<0.05)。与Decoction组比较,Intervention组TNF-α、IL-6、TGF-β、IL-4、IL-10 mRNA表达量在第1、4、8、12周无显著性差异(P>0.05);Intervention组IL-1 mRNA表达量在第1、8、12周低于Decoction组,但无统计学差异(P>0.05),在第4周明显低于Decoction组,有统计学差异(P<0.05)。与Prednisone组比较,Decoction组和Intervention组TNF-αmRNA表达量在第1周、第4周高于Prednisone组,有统计学差异(P<0.05),第8、12周低于Prednisone组,有统计学差异(P<0.05);Decoction组和Intervention组IL-1 mRNA表达量在第1周高于Prednisone组,有统计学差异(P<0.05),第4、8、12周与Prednisone组比较均无统计学差异(P>0.05);Decoction组和Intervention组IL-4 mRNA表达量在第1周低于Prednisone组,有统计学差异(P<0.05),在第4、8周IL-4 mRNA表达量高于Prednisone组,无统计学差异(P>0.05),在第12周明显高于Prednisone组,有统计学差异(P<0.05);Decoction组和Intervention组IL-6 mRNA表达量在第1周、第4周均高于Prednisone组,有统计学意义(P<0.05),在第12周明显低于Prednisone组,有统计学意义(P<0.05)。Decoction组和Intervention组IL-10 mRNA在第1、4、8周与Prednisone组表达量相当,无统计学差异(P>0.05),在第12周均明显高于Prednisone组,有统计学差异(P<0.05)。Decoction组和Intervention组TGF-βmRNA表达量在第8周、第12周较Prednisone组低,且在第12周明显低于激素组,有统计学差异(P<0.05)。结论Th1/Th2免疫失衡是放射性肺损伤发生发展的重要影响因素之一。通过调控TNF-α、IL-1α、IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β水平从而调节Th1/Th2功能失衡是养阴清热化瘀方防治放射性肺损伤的作用机制之一。实验三养阴清热化瘀方对放射性肺损伤大鼠肺组织TLR4/NF-κB信号通路分子的影响目的探讨养阴清热化瘀方是否通过TLR4/NF-κB信号转导机制发挥防治放射性肺损伤的作用。方法采用随机数字表法将162只雌性Wistar大鼠随机分为6组,Control组、Model组、Decoction组、Intervention组、PDTC组、Prednisone组,除空白对照组外,其他5组均以6MV X射线右肺单次20Gy照射制作大鼠放射性肺损伤模型。在第1、4、8、12周处死大鼠,用WB法检测大鼠肺组织TLR4、NF-κB P65、IKKα和IKKβ蛋白表达。结果与Control组比较,各照射组大鼠肺组织TLR4、NF-κB P65、IKKα和IKKβ蛋白表达量明显高于Control组,有统计学意义(P<0.01)。Decoction组和Intervention组第1、4、8、12周肺组织中TLR4、NF-κB P65、IKKα和IKKβ蛋白表达量均明显低于Model组1、4、8、12周(P<0.01)。Decoction组第1、4、8、12周肺组织中TLR4、NF-κBP65、IKKα和IKKβ蛋白表达量与Intervention组无明显差异(P>0.05)。Decoction组和 Intervention组肺组织中IKKβ蛋白表达量第8周明显高于Prednisone组(P<0.05),第1、4、12周均明显低于Prednisone组(P<0.05);Decoction组和Intervention组肺组织中IKKα蛋白表达量第1周明显高于Prednisone组(P<0.05),第12周明显低于Prednisone组(P<0.05);Decoction组和Intervention组肺组织中NF-κB p65蛋白表达量第1、4周明显高于Prednisone组(P<0.05),在第8周、第12周,无统计学意义(P>0.05);Decoction组和Intervention组肺组织中TLR4蛋白表达量第1周、第4周、8周高于Prednisone组(P<0.05),第12周与Prednisone组无明显差别(P>0.05)。PDTC组肺组织中TLR4蛋白表达量和模型组比较,无统计学差异(P>0.05)。PDTC组大鼠肺组织NF-κB P65、IKKα和IKKβ蛋白表达量低于Decoction组、Intervention组、Prednisone组(P<0.01)。结论TLR4/NF-κB信号通路在放射性肺损伤发生发展中起重要作用;养阴清热化瘀方可降低放射性肺损伤大鼠肺组织TLR4、NF-κB P65、IKKα、IKKβ蛋白表达,且这些指标和放射性肺损伤发生程度均呈明显的正相关,其机制可能与养阴清热化瘀方调控TLR4/NF-κB信号转导通路信号分子表达有关。