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炎症是人体抵抗外源病毒入侵的一个重要的防御性过程,是机体受到外界刺激时产生的一种自我保护形式。一般情况下对人体是有益的,但当炎症超过人体所需时就会伴随一些慢性疾病的产生。根据近年来报道显示,炎症因子的产生是一个大量消耗能量的过程。脂肪细胞不仅可以大量的储存能量,还是一个活跃的内分泌器官。许多慢性疾病的发病机制都与脂肪细胞的数量和体积有着密切的联系。茶多酚(TP)作为具有潜在疗效的羟基类化合物对诱发的病症能够起到很好的调控作用,因而受到广泛的关注。本文以3T3-L1炎症脂肪细胞为模型,以AMPK/SIRT1为抗炎调控新靶点,研究TP对脂肪炎症细胞抗炎的作用机制,这为茶多酚在脂肪炎症细胞抗炎及与炎症发生相关代谢疾病的预防上提供一种新的思路和药物作用新靶点。试验结果如下:1、明确了不同浓度TP对炎性因子m RNA表达的作用3T3-L1脂肪细胞完全分化成熟后,使抗肿瘤因子α浓度达到10 ng/ml(除去正常组)刺激24h,建立炎性模型。吸出液体,用PBS清洗1遍,分别添加含0、10、25、50、100μg/ml TP的培液连续培养48 h,以不添加任何药物的细胞作为空白对照组。收集细胞,采用荧光定量PCR测定促炎性、抗炎性因子及炎性酶的基因表达水平。结果显示:与对照组相比,TNF-α能够显著增加IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、COX-2和i NOS基因表达水平,降低IL-4和IL-10基因表达水平。不同浓度TP干预后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、COX-2和i NOS基因表达水平逐渐降低,m RNA表达根据TP浓度提升而下降,IL-4和IL-10m RNA表达则正好相反。2、明确了不同浓度TP对AMPK/SIRT1通路及下游相关靶点的作用将3T3-L1脂肪细胞分化成熟后,运用Western-blot技术手段,测定不同添加浓度TP对AMPK、SIRT1、NF-κB和Foxo3a蛋白表达的影响,比较不同处理组AMPK(Thr172)、SIRT1(Ser27)、NF-κB-P65(Ser276)和Foxo3a(Ser253)磷酸化水平的变化。结果显示,与对照组相比TNF-α组脂肪细胞AMPK、SIRT1、NF-κB和Foxo3a总蛋白无明显差异,而AMPK(Thr172)、SIRT1(Ser27)、NF-κB-P65(Ser276)和Foxo3a(Ser253)的磷酸化表达明显减少,磷酸化水平降低。各个浓度TP干预后他们会相继升高,呈现剂量依赖关系。3、确定了激活剂和抑制剂对炎性因子基因表达的作用建立脂肪细胞炎性模型,分别添加含100μg/ml TP、100μg/ml TP+1m M AMPK激活剂(AICAR)、100μg/ml TP+20μM AMPK抑制剂(Compound C)、100μg/ml TP+40μM SIRT1激活剂(Resveratrol)、100μg/ml TP+20m M SIRT1抑制剂(Nicotinamide)和100μg/ml TP+10μM NF-κB信号阻断剂(PDTC)的培养基继续培养48h,以不添加任何药物的细胞作为空白对照组。收集细胞对IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、COX-2和i NOS m RNA表达进行测定。荧光定量PCR结果显示:与对照组相比,TNF-α能够显著增加IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、COX-2和i NOS基因表达水平,降低IL-4和IL-10基因表达水平(P<0.05)。添加含100μg/ml TP的培养基能够有效降低IL-6、IL-1α、IL-1β、IL-12、COX-2和i NOS基因表达,增加IL-4和IL-10基因表达。添加含100μg/ml TP+1m M AMPK激活剂(AICAR)和100μg/ml TP+40μM SIRT1激活剂(Resveratrol)的培养基能够激活AMPK和SIRT1的活性,效果优于TP单独使用。而添加含100μg/ml TP+20μM AMPK抑制剂(Compound C)和100μg/ml TP+20m M SIRT1抑制剂(Nicotinamide)的培养基则抑制AMPK和SIRT1的活性,效果不如添加激活剂好,甚至不如TP单独作用效果显著。4、确定了激活剂和抑制剂对AMPK/SIRT1信号途径及下游靶点的作用将3T3-L1脂肪细胞分化成熟后,运用Western-blot测定不同处理组中AMPK、SIRT1、NF-κB、Foxo3a、p53和c-Jun蛋白表达情况,比较不同处理组AMPK(Thr172)、SIRT1(Ser27)、NF-κB-P65(Ser276)、Foxo3a(S253)、p53(ser15)和c-Jun(S73)的磷酸化水平的变化。结果显示,与对照组相比TNF-α组脂肪细胞AMPK、SIRT1、NF-κB、Foxo3a、p53和c-Jun总蛋白无明显差异,而AMPK(Thr172)、SIRT1(Ser27)、NF-κB-P65(Ser276)和Foxo3a(S253)的磷酸化表达明显减少,p53(ser15)和c-Jun(S73)磷酸化表达显著增加。100μg/ml TP干预后AMPK(Thr172)、SIRT1(Ser27)、NF-κB-P65(Ser276)和Foxo3a(S253)磷酸化表达逐渐增加,p53(ser15)和c-Jun(S73)磷酸化表达逐渐降低。添加含100μg/ml TP+1m M AICAR和100μg/ml TP+40μM Resveratrol的培养基后,效果优于TP单独使用。添加含100μg/ml TP+20μM Compound C和100μg/ml TP+20m M Nicotinamide的培养基对磷酸化的表达没有激活剂效果好,甚至不如TP单独使用效果显著。