【摘 要】
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为研究Fyn在大脑发育过程神经元迁移中的作用，本试验以小鼠大脑组织提取RNA为模板通过PCR方法克隆小鼠Fyn基因，构建Fyn真核表达载体。根据小鼠Fyn mRNA序列，结合网上在线设计工具选择靶序列，设计shRNA序列及阴性对照序列构建干扰载体。首先进行细胞转染，在RNA和蛋白水平检测Fyn表达变化，验证载体的有效性并筛选有效的干扰片段，再利用子宫内胚胎电击转染技术在体内研究超表达和干扰Fyn对
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为研究Fyn在大脑发育过程神经元迁移中的作用，本试验以小鼠大脑组织提取RNA为模板通过PCR方法克隆小鼠Fyn基因，构建Fyn真核表达载体。根据小鼠Fyn mRNA序列，结合网上在线设计工具选择靶序列，设计shRNA序列及阴性对照序列构建干扰载体。首先进行细胞转染，在RNA和蛋白水平检测Fyn表达变化，验证载体的有效性并筛选有效的干扰片段，再利用子宫内胚胎电击转染技术在体内研究超表达和干扰Fyn对神经元迁移的影响，初步探讨Fyn在神经元迁移中的作用。试验结果如下：1.成功克隆得到包含CDS区的小鼠Fyn基因，构建真核表达载体pM-fyn，经鉴定重组载体中Fyn序列无突变位点和缺失。用pM-fyn转染中国仓鼠卵巢（Chinese HamsterOvary，CHO）细胞，分别在RNA和蛋白水平检测到转染了重组载体的细胞Fyn表达显著提高；转染后24h对细胞进行免疫荧光染色发现，Fyn超表达引起细胞产生丝状伪足。2.构建了Fyn干扰载体，经鉴定插入载体的shRNA序列与设计的序列完全一致。转染细胞并在RNA和蛋白水平检测Fyn表达变化，与对照组相比，shFyn-1能显著降低Fyn的表达。3.子宫内电击转染技术分别转染真核表达载体和干扰载体，上调和下调发育的大脑皮质神经元中Fyn的表达，与对照组相比，转染了Fyn表达载体的神经元在迁移过程中分枝增多，转染了干扰载体的神经元在迁移的最后阶段顶突起增长，但均不影响大脑皮质正常分层结构的形成，神经元可以迁移到达正确的位置。试验结果表明，Fyn超表达在体外培养的CHO细胞中引起丝状伪足的产生，在体内引起迁移神经元分枝增多，推测Fyn通过影响细胞骨架重排改变细胞形态。干扰Fyn的表达使迁移神经元在迁移的最后阶段顶突起增长，说明Fyn可能在胞体位移式迁移中发挥重要作用。
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