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miRNA是一类在动植物中广泛存在的,长约22nt的非编码单链RNA,可通过调节基因的转录后翻译对胚胎早期发育、细胞增殖分化、脂质代谢以及肿瘤生成等进行调控。大量研究发现miRNA对脂肪细胞的增殖、分化及脂质代谢有重要的调控作用。本试验通过研究miR-183与miR-135a对山羊前体脂肪细胞分化的影响,为进一步揭示miRNA对山羊脂肪沉积的调控机理提供理论依据。本研究克隆了山羊miR-183与miR-135a的成熟序列,利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测了miR-183与miR-135a在成年藏山羊10个组织(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、大脑、背最长肌、皮下脂肪、肾周脂肪以及肠系膜脂肪)中的表达模式。用油红O染色观察山羊的前体脂肪细胞诱导分化过程中细胞中的脂肪滴沉积并用RT-qPCR检测分化过程中PPARy, miR-183和miR-135a的表达变化。用人工合成的miRNA mimics和inhibitors转染山羊前体脂肪细胞,在细胞中过表达／抑制表达miR-183与miR-135a。检测转染后细胞中脂肪分化的关键基因以及脂肪酸合成相关基因的表达量变化。结果如下：1.克隆得到了山羊miR-183和miR-135a的成熟序列。miR-183的成熟序列为5’-UAUGGCACUGGUAGAAUUCACUG-3’; miR-135a的成熟序列为5’-UA-UGGCUUUUUAUUCCUAUGUGA-3’.2.RT-qPCR检测结果表明miR-183和miR-135a在被检测的10个山羊组织中均有表达,且不同组织间的表达量差异显著(P<0.05)。miR-183和miR-135a在组织中的表达模式不同但在不同解剖部位脂肪组织中,miR-183和miR-135a具有相似的表达模式。3.山羊前体脂肪细胞培养5d左右,细胞发生接触抑制导致细胞生长停滞,少数细胞中开始出现微小脂滴,细胞由增殖阶段进入分化阶段。在成脂诱导的第8d细胞内脂滴融合形成大的脂肪滴,细胞呈现出成熟脂肪细胞的特征。RT-qPCR检测结果显示在山羊前体脂肪细胞分化过程中,脂肪分化关键因子PPARy的表达整体上呈上升趋势,在诱导分化第6d时PPARy的表达量达到最高。4.miR-183和miR-135a在山羊前体脂肪细胞分化过程中表达趋势不同,在细胞分化过程中miR-183的表达总体上呈现上升趋势,miR-135的表达呈下降趋势。·5.山羊前体脂肪细胞中过表达miR-183能提高脂肪细胞分化关键基因PPARγ、C/EBPα以及脂肪酸合成相关基因SREBP-1、FAS和ACC的表达,并增加细胞中脂肪滴的累积；抑制miR-183表达则导致上述相关基因的表达下调同时细胞中脂肪酸的沉积减少,表明miR-183对山羊前体脂肪细胞的分化有促进作用。6.过表达miR-135a后,脂肪细胞分化关键基因PPARγ、C/EBPα以及脂肪酸合成相关基因SREBP-1、FAS和ACC的表达下调,同时细胞中脂肪酸的含量减少；抑制山羊前体脂肪细胞中内源性miR-135a的表达后,上述相关基因的表达上调,细胞中脂肪滴的沉积增加,说明miR-135a对山羊前体脂肪细胞的分化有抑制作用。