随着社会经济的发展,肥胖已成为全球流行性疾病。而内脏肥胖是胰岛素抵抗、2型糖尿病、代谢综合征、心脑血管疾病的最主要危险因素。机体能量摄取增加和／或能量消耗减少导致肥胖发生。棕色脂肪因为富含线粒体,可以使脂肪酸氧化所产生的能量以热量的形式散发,减少脂肪堆积,棕色脂肪功能的改变在肥胖的发生发展中起重要作用。近年来,在白色脂肪被发现也具有向棕色脂肪方向分化的特性后,白色脂肪棕色化在肥胖中的研究逐渐成为热点。MicroRNA(微小RNA, miRNA)在各种生物过程,包括脂肪细胞分化、合成代谢、胰岛素抵抗和食欲调节中发挥重要的调控作用。而且,MiRNA的作用具有组织特异性,对基因的调控更为精细,目前已成为研究热点。而调控白色脂肪棕色化的机理尚不清楚,与多种因素和转录因子有关。关于miRNA在白色脂肪棕色化方面的调控作用至今鲜有报道。本研究利用饮食诱导肥胖小鼠模型、肥胖人群和原代内脏脂肪细胞模型,以及miR-27b--本课题组在白色脂肪棕色化的其他研究中发现的miRNA,证实肥胖时小鼠和人内脏脂肪棕色化功能均下降,阐述miR-27b调控白色脂肪棕色化的分子机制--通过调控脂肪棕色化功能的关键转录因子Prdm16。进一步通过体内抑制miR-27b的作用,发现干涉miR-27b可以逆转肥胖时内脏脂肪棕色化功能的下降,改善机体胰岛素敏感性,为内脏肥胖及其代谢并发症的治疗提供新的策略。本研究分为三个部分：第一部分：内脏脂肪棕色化功能改变在肥胖小鼠中的研究第二部分：内脏脂肪棕色化功能改变影响肥胖的分子机理研究第三部分：内脏脂肪棕色化功能改变影响肥胖的临床研究第一部分：内脏脂肪棕色化功能改变在肥胖小鼠中的研究目的：内脏肥胖与胰岛素抵抗、2型糖尿病、代谢综合征、心脑血管疾病的发生发展密切相关,严重危害人们的健康。肥胖是能量摄入和／或能量消耗失衡导致的。研究表明,增强棕色脂肪功能,通过增加脂肪酸氧化,将多余的能量转换为热能散失,可以减少脂肪堆积,肥胖时棕色脂肪功能代偿性增强。目前人体内的另一种脂肪组织--白色脂肪被发现具有棕色化功能,已成为棕色化研究的热点。而肥胖时内脏脂肪棕色化功能如何改变尚未见报道。第一部分的研究首先明确肥胖小鼠内脏脂肪棕色化功能的变化。方法：构建饮食诱导肥胖小鼠(C57BL/6J)模型,小鼠及其体脂称重；实时荧光定量PCR检测脂肪因子和炎症因子的表达,进行葡萄糖耐量试验,证实模型构建成功。分离附睾旁内脏脂肪组织,进行HE和Ucp1免疫组化染色；实时荧光定量PCR检测棕色化标志基因Ucp1, Prdm16, Cidea, Cox8b和Pgc1α的表达,Western blot检测Ucp1和Prdm16的蛋白表达。分离肥胖小鼠腹股沟皮下、附睾旁和肾周脂肪,检测不同部位白色脂肪组织中miR-27b和Ucpl的相对表达量。MiR-27b是本课题组在关于白色脂肪棕色化的其他研究中发现的miRNA。结果：饮食诱导肥胖小鼠体重和各部位白色脂肪重量均增加,胰岛素抵抗相关因子分泌增加,胰岛素敏感相关因子分泌减少,葡萄糖耐量减退,HE染色示脂肪组织中脂滴明显增大,说明饮食诱导肥胖小鼠模型建立成功。内脏脂肪Ucp1染色在肥胖小鼠明显减少；内脏脂肪棕色化功能标志基因Ucp1, Prdm16, Cidea, Cox8b和Pgc1α的表达下降；Ucp1和Prdm16的蛋白表达下降。不同部位白色脂肪组织中miR-27b的表达在内脏脂肪中最高,而Ucp1在内脏脂肪表达最低；肥胖小鼠内脏脂肪miR-27b表达较正常饮食组升高。结论：肥胖小鼠内脏脂肪的棕色化功能明显下降。MiR-27b在肥胖小鼠内脏脂肪中表达升高。MiR-27b可能与肥胖时内脏脂肪棕色化功能下降有关。第二部分：内脏脂肪棕色化功能改变影响肥胖的分子机理研究目的：白色脂肪在受到寒冷、肾上腺素刺激以及一些转录因子如Prdm16的调控下可以向棕色脂肪分化,但是其具体分子机制尚不清楚。在第一部分研究中我们已经明确肥胖时内脏脂肪的棕色化功能下降,同样,其发生的机理仍不明确。MiRNA在白色脂肪棕色化调控中的研究目前较少。MiR-27b是本课题组在关于白色脂肪棕色化的其他研究中发现的miRNA。本研究的第二部分从miRNA调控白色脂肪棕色化入手,探讨肥胖时内脏脂肪棕色化功能下降的分子机制。方法：体外采用酶消化法分离培养3周龄C57BL/6J、鼠原代内脏前脂肪细胞,利用LNA修饰的anti-miR-27b或Pre-miRTM miR-27b Precursor片段(miminc-miR-27b)干涉或过表达miR-27b,诱导分化前脂肪细胞；实时荧光定量PCR检测棕色化标志基因Ucp1, Prdm16, Cidea, Cox8b和Pgcla的表达：Western blot检测Ucp1和Prdm16的蛋白表达；Seahorse XF24Extracellular Flux Analyzer测定细胞耗氧率。三种数据库同时预测miR-27b的靶基因,采用荧光素酶报告基因技术证实miR-27b与靶基因之间的相互作用。体内在构建饮食诱导肥胖小鼠模型的基础上,小鼠尾静脉注射慢病毒包装的miR-27b干涉质粒,一次性注射5×107TU。在注射慢病毒前后对小鼠进行称重,并进行胰岛素耐量试验；7天后处死小鼠,取各部位白色脂肪组织并称重；进行HE和Ucp1免疫组化染色；实时荧光定量PCR检测内脏脂肪棕色化标志基因Ucp1, Prdm16, Cidea, Cox8b和Pgcla的表达,Western blot检测Ucpl和Prdm16的蛋白表达。利用实验动物代谢测量分析系统对小鼠进行整体氧耗测定(24h)。结果：体外干涉miR-27b的表达可以增强原代内脏脂肪细胞棕色化标志基因Ucp1,Prdm16, Cidea, Cox8b和Pgclα的基因表达和Ucp1、Prdm16的蛋白表达,并增加细胞氧耗；而过表达miR-27b可以抑制内脏脂肪细胞棕色化标志基因Ucp1, Prdm16, Cidea, Cox8b和Pgclα的表达以及Ucp1和Prdm16的蛋白表达,降低细胞氧耗。MiR-27b通过作用于Prdm16的3’非翻译区(3’UTR),调节Prdm16的蛋白表达,进而调控内脏脂肪棕色化功能。体内干涉]miR-27b表达后,肥胖小鼠内脏脂肪中miR-27b的靶基因Prdm16的蛋白表达升高,说明miR-27b干涉成功。同时,内脏脂肪棕色化标志基因Ucpl,Prdml6, Cidea, Cox8b和Pgclα的表达增加,Ucpl的蛋白表达也增加；小鼠整体耗氧量增加,而摄食与活动量无明显改变。内脏脂肪脂滴变小,小鼠的胰岛素敏感性改善。结论：MiR-27b通过抑制靶基因Prdm16的蛋白表达,调控内脏脂肪细胞的棕色化功能。体内干涉miR-27b的作用可以逆转肥胖小鼠内脏脂肪棕色化功能的下降,缩小内脏脂肪脂滴,改善胰岛素敏感性。尽管体重及体脂量无明显变化,miR-27b仍为我们治疗肥胖及其代谢并发症提供了新的思路和策略。第三部分：内脏脂肪棕色化功能改变影响肥胖的临床研究目的：内脏肥胖的危害明显且发病机理复杂,寻求治疗内脏肥胖的方法一直是国内外学者研究的热点。增强白色脂肪棕色化可以增加能量消耗,逐渐成为治疗肥胖及其代谢并发症的新途径。本研究的第二部分已经在动物体内外证实miR-27b对内脏脂肪棕色化功能具有调控作用。第三部分旨在阐明肥胖人群内脏脂肪棕色化功能的改变,以及miR-27b在人内脏脂肪中对棕色化功能的调控,进一步阐明miR-27b调控内脏脂肪棕色化功能的临床意义,为肥胖的临床治疗提供新思路。方法：收集择期行胆囊切除术(因胆囊炎或胆囊结石,排除肿瘤及严重肝肾疾病)的外科患者的大网膜脂肪组织,同时记录患者基本资料。分为BM1<25kg/m2和BMI>25kg/m2两组,实时荧光定量PCR检测内脏脂肪分泌因子Adiponectin、Leptin和MCP-1的表达,内脏脂肪miR-27b的表达以及棕色化标志基因UCP1,PRDM16,CIDEA和PGCla的水平。酶消化法分离培养人内脏原代前脂肪细胞,干涉或过表达miR-27b,并进行诱导分化,定量PCR检测棕色化标志基因UCP1,PRDM16,CIDEA和PGCla的表达。结果：与BMI<25kg/m2组比较,BMI>25kg/m2组人群内脏脂肪棕色化标志基因UCP1, PRDM16和CIDEA的表达下降；miR-27b表达升高。在人内脏原代前脂肪细胞干涉miR-27b导致棕色化标志基因UCP1, PRDM16, CIDEA和PGC1α的表达升高；过表达miR-27b导致UCP1, PRDM16, CIDEA和PGCla的表达下降。结论：肥胖人群内脏脂肪组织的棕色化功能较体重正常的人群下降,而miR-27b的表达升高。miR-27b同样调控人内脏脂肪细胞的棕色化功能。