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人类T细胞白血病1型病毒(Human T-cell leukemia virus type 1,HTLV-1)是一种逆转录病毒,它的感染可引起成人T细胞白血病(Adult T-cell leukemia,ATL)的发生。HTLV-1病毒除了表达病毒结构蛋白gag、pol和env之外,还编码了包括p12、p21、p30、p13、Tax和HBZ等具有调节功能的蛋白。其中Tax蛋白是HTLV-1病毒的关键蛋白,它能够通过调控肿瘤细胞内的多条信号通路促进肿瘤的发生。有研究显示,Tax能够抑制TGFβ(Transforming Growth Factorβ)信号通路对肿瘤细胞生长的负调控作用,从而促进ATL细胞的恶性增殖。然而在ATL发展的后期,Tax的表达会逐渐下降甚至不表达。因此,在ATL后期肿瘤细胞内是通过何种机制抑制TGFβ信号通路,从而促进ATL细胞恶性增殖的呢?已有报道显示,YAP是Hippo信号通路的关键蛋白。在哺乳动物体内,Hippo/YAP通路除了能调控器官大小和细胞再生外,它还能通过调控其他信号通路从而影响细胞的生长。而且已有报道显示TGFβ及Hippo/YAP信号通路可能存在相互作用。据此,我们推测:在ATL细胞中,YAP是否可以通过调控TGFβ信号通路,从而促进成人T细胞白血病的发生呢?为了证明这一推断并阐明其分子机制,本课题从以下几个方面进行研究:第一部分:YAP在ATL细胞株中高表达及其分子机制我们首先通过RT-PCR技术检测了ATL细胞株中YAP mRNA的表达情况。我们发现,相较于对照组细胞株(Hut78、MOLT-4、Jurkat),ATL细胞株(MT-4、TL-Om-1、ATL-T、ATL-2、MT-1、MT-2)中YAP基因存在不同程度的高表达。为了进一步研究YAP在ATL细胞株中高表达的分子机制,我们进行了双荧光素酶报告基因实验。结果表明,HTLV-1编码的Tax蛋白能够激活YAP的启动子活力。同时,Western bolt实验进一步证实了,在T细胞中过表达Tax蛋白可以促进YAP蛋白的表达。第二部分:YAP对TGFβ信号通路的调控作用为了研究YAP对TGFβ信号通路是否具有调控作用,我们首先通过报告基因实验检测发现,YAP能够显著抑制TGFβ信号通路。我们还利用不同的TGFβ信号通路报告基因质粒以及多种细胞株进行实验,均证实了YAP对TGFβ信号通路的抑制作用。随后,我们通过慢病毒感染的方式构建了沉默YAP及过表达YAP的ATL-T稳定株,并利用报告基因实验检测稳定株中的TGFβ信号通路激活情况。实验结果显示,在YAP沉默稳定株中,随着ATL-T细胞中YAP表达量的下调,TGFβ信号通路的激活有所上调。而在YAP的过表达稳定株内,TGFβ信号通路的活化受到显著抑制。因此,该部分实验进一步证明了在ATL-T细胞中TGFβ信号通路受到了YAP的负调控。第三部分:YAP调控TGFβ信号通路的分子机制为了研究YAP调控TGFβ信号通路的分子机制,我们首先运用Western blot实验检测YAP对TGFβ信号通路关键蛋白Smad3的半衰期是否存在影响。结果显示YAP对Smad3蛋白的降解无任何影响。随后,我们通过免疫共沉淀实验发现,YAP能与Smad3蛋白结合。我们还利用YAP及Smad3的突变体进行免疫共沉淀实验发现,YAP蛋白的WW1及部分TAD结构域参与了与Smad3的结合,且YAP蛋白主要作用于Smad3蛋白的MH2结构域。我们随后发现YAP并不影响Smad3与Smad4、及Smad7的结合作用。同时,报告基因实验显示,Smad3的共转录激活因子p300能回复被YAP抑制的TGFβ信号通路,而且免疫共沉淀实验显示YAP抑制Smad3与p300的结合。此外,免疫共沉淀实验还表明YAP可加强抑制型Smad蛋白Smad7与TGFβI型受体的结合。第四部分:YAP通过抑制TGFβ信号通路促进ATL细胞生长为了研究YAP是否可以通过抑制TGFβ信号通路从而影响ATL细胞的生长,我们首先利用沉默YAP的ED稳定株及过表达YAP的ATL-T稳定株。通过MTT实验我们发现,过表达YAP能够促进ATL-T细胞的生长。流式细胞术检测结果显示,沉默YAP影响了ED细胞周期G1/S期的转换,进而影响细胞生长。随后,我们构建了过表达YAP蛋白的Mv-1Lu细胞株。通过MTT实验检测发现,空白对照组Mv-1-Lu细胞在处理TGFβ后,细胞的死亡率会会随着TGFβ的浓度升高而逐渐上升。然而过表达YAP的Mv-1Lu细胞在处理TGFβ的条件下细胞的死亡率并没有发生显著的改变。该结果提示,YAP拮抗了TGFβ因子对细胞生长的抑制作用。最后,我们运用qRT-PCR技术检测发现,在ATL细胞株中过表达YAP可显著抑制TGFβ下游靶基因——细胞周期抑制因子p15基因的表达,从而促进细胞周期的转换以及细胞生长。综上所述,我们通过本研究发现,在ATL细胞中YAP高表达,HTLV-1编码的病毒蛋白Tax促进了YAP的表达。YAP可以通过与Smad3蛋白结合,从而抑制了其与共转录因子p300的结合。同时研究证明YAP还可通过加强Smad7与TGFβI型受体的结合。最后,研究发现YAP可以显著抑制TGFβ信号通路及其下游靶基因p15的表达,最终促进ATL细胞的生长。本研究不仅阐明了在Tax表达缺失的ATL后期,YAP抑制TGFβ信号通路并促进细胞生长的分子机制,还将为ATL的临床治疗提供新的策略和靶点。