木犀草素调控caspase-11依赖性焦亡在脓毒症肺损伤中的作用和机制探讨

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目的:明确木犀草素(Luteolin,Lut)对脓毒症肺损伤的治疗作用。探究木犀草素对肺组织细胞caspase-11依赖性焦亡的影响及潜在机制。方法:本研究采用C57BL/6小鼠(n=25)进行动物实验。15只鼠随机分为3组,分别是正常对照组(Control),盲肠结扎穿刺处理组(cecal ligation and puncture,CLP)和木犀草素治疗组(Lut+CLP),每组5只。剩下的10只鼠随机分为调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)耗竭组(CLP+Lut+anti-CD25)和IL-10中和组(CLP+Lut+anti-IL-10),每组5只。CLP组使用5%异氟烷诱导麻醉,2%异氟烷维持麻醉。做正中做切口,在距离盲肠末端1cm处结扎穿刺。Lut+CLP组在进行CLP前1h腹腔注射木犀草素0.4mg,1h之后进行CLP。Control组使用腹部注射等量的PBS溶液进行对照实验。CLP+Lut+anti-CD25组小鼠在CLP前1h注射0.2 mg抗鼠CD25单抗。CLP+Lut+anti-IL-10组在CLP后30min用抗IL-10中和抗体,对照组采用同等剂量的IgG。造模完成后提取小鼠血清和支气管肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid,BALF)、肺组织、脾脏和外周血。用抗大鼠苏木精—伊红染色(hematoxylin-eosin staining,H&E)和肺部湿/干(W/D)重量比评价肺损伤的严重程度。用ELISA法检测血清和BALF中细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17A和IL-10)的表达。计数BALF中中性粒细胞的数量。采用免疫组织化学方法检测肺组织IL-10和MPO的表达。活性氧(Reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒检测肺组织ROS水平,q RT-PCR和WB检测肺组织谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,Gpx4)的表达。流式细胞技术检测脾脏和外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中Treg细胞的比例。WB检测肺组织中天冬氨酸蛋白水解酶11(Cysteinyl aspartate specific proteinase-11,caspase-11)蛋白、天冬氨酸蛋白水解酶1(Cysteinyl aspartate specific proteinase-11,caspase-1)蛋白、GSDMD蛋白、IL-1α和IL-1β蛋白表达水平。结果:1.光镜下观察小鼠肺部病理组织切片,相比于Control组,CLP组、CLP+Lut+anti-CD25组、CLP+Lut+anti-IL-10组的肺组织可见明显水肿、肺泡壁广泛增厚、肺泡塌陷、肺泡内出血和大量炎症细胞浸润,有显著性差异(p<0.01)。肺W/D结果显示木犀草素预处理后,CLP+Lut组明显改善肺损伤。使用Lut治疗后,Lut+CLP组肺损伤相较CLP组肺组织损伤程度降低。2.CLP+Lut组治疗组小鼠血清和BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-17A等炎症因子表达低于CLP组(p<0.001)。测定BALF中性粒细胞数量和MPO活性表明,CLP显著增加BALF中性粒细胞活性和MPO表达,而Lut治疗显著降低BALF中性粒细胞活性和MPO表达。3.Lut预处理后,相比于Control组,CLP组PBMC中Treg细胞比例增高,CLP+Lut组进一步增高。脾脏Treg细胞比例,CLP+Lut组较CLP组进一步增高(p<0.001)。与CLP组比较,CLP+Lut组血清和BALF中IL-10表达升高(p<0.001)。与Lut组相比,抗CD25抗体使用后,Treg细胞比例下降,IL-10表达水平明显下降,损伤程度加重。4.Lut预处理后,CLP组肺组织,细胞焦亡相关蛋白(cleaved-caspase-11、cleaved-GSDMD、IL-1α和IL-1β)表达显著降低(p<0.01)。相比于CLP组,Lut组肺组织内caspase-11和caspase-1的表达明显降低(p<0.05)。抗IL-10中和抗体后,焦亡相关的蛋白GSDMD、caspase-11、caspase-1、IL-1α和IL-1β表达显著升高。结论:Lut能减轻CLP诱导的小鼠实验动物模型肺损伤,并减轻肺组织细胞caspase-11依赖的细胞焦亡。其作用可能与调节Treg细胞比例以及其产生IL-10相关。
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