根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的多年生黑麦草(Lolium perenne L.)遗传转化

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多年生黑麦草(Lolium perenne L.)是优良的牧草和草坪草,是畜牧业和草坪业重要的产业支柱。由于自交不亲和,传统遗传改良困难而复杂。生物技术尤其是转基因技术对其遗传改良带来希望。本研究通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,对多年生黑麦草进行遗传转化,成功地将外源报告基因或目的基因导入至多年生黑麦草中,获得转基因植株。 研究首先对多年生黑麦草的转化条件进行了优化,建立起根癌农杆菌介导的遗传转化方法。在选择的9种多年生黑麦草成熟胚诱导的愈伤组织中,经用根癌农杆菌侵染、百龙霉素选择,从4种多年生黑麦草材料(金牌美达丽、神枪手、多福和利美斯)中获得了抗性愈伤组织和抗性植株。 在利用报告基因进行转化中,金牌美达丽、神枪手、多福的抗性植株是由携质粒pCAMBIA2301的农杆菌EHA105转化后获得的。该质粒含有选择基因npt Ⅱ和报告基因gus,均由CaMV35S启动子驱动。经PCR、GUS组织染色验证结果表明,绝大多数抗性植株是转npt Ⅱ和gus基因的植株。其中金牌美达丽从1次转化中获得9株转基因植株:神枪手从2次转化中分别获得4和12苗;从3次转化中分别获得转基因多福植株17、18和15苗。最高转化效率可以达到4.3%。烟草汁在一定程度上有提高转化效率的作用。以质粒pCAMBIA2301为模板进行探针PCR地高辛标记,Southern bloting分析金牌美达丽9株转基因植株npt Ⅱ基因,结果表明,转基因植株外源基因拷贝数低,其中6株为单拷贝,
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