消化道恶性肿瘤在所有恶性肿瘤的发病和死亡中占据前列，其中消化道实质性脏器肿瘤如肝癌、胰腺癌等肿瘤的预后差，空腔器官的恶性肿瘤如胃癌、大肠癌等发病率高，预后也不理想。2002年全球新发、死亡的癌症病例中，消化系统肿瘤中的胃癌和肝癌高居癌症死亡原因的第2、3位，分别为70万和59.8万。严重危害着人们的生命和健康。因此做好消化道恶性肿瘤的防治工作在一个地区的癌症控制规划中占有很重要的地位。本课题选择在消化道恶性肿瘤中占有非常重要地位而又具有代表性的胃癌和肝癌进行研究。胃癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤，仅次于肺癌、乳腺癌和肠癌之后，位居发病率的第4位、死因的第2位。而我国是胃癌高发国之一，与世界各国比较，我国男、女性胃癌世界调整死亡率均居于首位。在我国，胃癌发病率和死亡率均占各种恶性肿瘤之首，而且近年来发病有明显年轻化趋势。胃癌病因尚未完全阐明，起病隐匿，早期常因无明显症状而漏诊，防治工作存在许多困难，相当多的胃癌患者发现时已经是晚期。目前胃癌切除术5年生存率为20％～30％，而早期胃癌根治术5年生存率可达90～95％，由此可见提高早期胃癌诊断率是至关重要的。一直以来，胃癌的早期诊断及其治疗水平的提高受到医学界的高度关注。肝癌也是我国常见的恶性肿瘤之一，根据上海市1998-2001年上海全市居民肿瘤登记统计，全市男性平均年发病率为39.86／10万，女性为16.45／10万。肝癌的早期诊断亦比较困难。肝癌就诊时早、中、晚三期分别占29.9％、51.5％和18.6％；目前以肝切除术为代表的外科治疗仍是原发性肝癌首选治疗方法，手术切除率仅占46.3％。全部肝癌患者的1、3、5年生存率分别为66.1％、39.7％和32.5％。晚期病人的半年、1年生存率为52.5％、14.7％。而早期患者的1、3、5年生存率分别为93.5％、70.1％和59.1％。可见，肝癌的早期发现和早期诊断是肝癌获得手术并取得较好疗效的关键。这也表明了肝癌早期发现、早期诊断和早期治疗对提高肝癌治疗效果是非常重要的。一直以来，早期诊断恶性肿瘤的研究集中在肿瘤标志物上，并取得了巨大的成功。恶性肿瘤在增生、凋亡和分化及转移等多个环节的特点均可追朔到多种基因表达的改变，而这些改变最终都会导致细胞内蛋白质表达水平的变化，从而影响细胞的生命活动，这些与肿瘤相关蛋白质的改变或多或少在肿瘤组织、血液或者其他体液中留下一些可以找到的证据，即肿瘤标志物。目前，可用于胃癌诊断的血清标记物有CEA、CA50、CA199、CA724、SIMA、端粒酶等，用放射免疫等方法检测这些标记物，对于胃癌的诊断和判断术后有无转移复发有一定的临床意义，但单项指标的灵敏度仅为18-40％，联合应用的结果虽然可达60-80％，但假阳性率较高，难以作为早期诊断指标。同样的，甲胎蛋白(AFP)是肝癌经典的诊断指标，但AFP对肝癌诊断阳性率一般为60％-70％，虽然联合检测AFP和肿瘤特异性生长因子可以提高检测阳性率，但在原发性肝癌诊断中存在着较高的假阳性率，因此，寻找更为精确的特征性的蛋白标志物是早期诊断原发性肝癌的当务之急。然而血清肿瘤标志物的寻找存在许多的困难。几乎全部的肿瘤特征蛋白质浓度都很低，所以，发现和鉴定这些低丰度的蛋白质成为早期诊断这些肿瘤的新任务；其次，蛋白浓度是动态变化的，应激状态、疾病或治疗后就可能会发生显著的变化，从而影响了检测。近年来，随蛋白质组研究技术和生物信息处理技术的迅猛发展，使人们从蛋白质整体水平动态研究肿瘤的发生发展已成为可能。在传统的检测方法中，双向凝胶电泳技术是一项检测血清中蛋白标记物浓度的成熟方法。通常，双向凝胶电泳技术与质谱分析技术配对使用来鉴别蛋白质，为了保证分析和临床应用的可靠性，筛选生物标记物的分析工作往往需要比较大量的样本，所以该方法费力又费标本，不适合大规模普查及临床检测。同时，双向凝胶电泳技术对于低分子量蛋白质和低丰度蛋白质的检测依然存在一定的盲区。所以，这一技术对于筛选特异的低丰度或低分子量的生物标记物存在许多的困难。表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术(surface-enhanced laser desorption／inionation-time of flight-mass spectra，SELDI-TOF-MS)的出现弥补了上述技术的许多不足和问题。它的优势有：一是可以直接用粗样本进行检验；二是可以进行大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质分析；三是样本消耗量少；四是它不仅能发现一种蛋白质或生物标记分子，还可发现不同的多种方式的组合蛋白质谱；五是可以验证基因组学方面的变化，并基于蛋白质特点发现新的基因等。2002年，Petricoin等学者利用该技术成功的建立了卵巢癌血清蛋白组波谱模型，检测敏感性为100％，特异性95％，阳性预测值94％，经过随后二年的二期临床研究后，该项技术已在美国正式开始应用于卵巢癌的筛查。因此，SELDI-TOF-MS技术的出现使应用少量临床样本即可检测到与疾病发展密切相关的低丰度蛋白成为可能，也使血清蛋白质组学诊断模式发展成为一种有价值的诊断标准。目前，利用该技术对中国人胃癌和肝癌蛋白组学研究尚不深入，为了寻找其可能的特征性蛋白质组学变化，并阐明这些蛋白质标志物在其早期诊断中的意义，本研究选择消化道肿瘤中死亡人数最高的胃癌和肝癌作为研究对象，并以慢性胃炎和肝硬化分别作为上述两种肿瘤的良性疾病对照，同时再与健康志愿者进行对比，利用蛋白质芯片SELDI-TOF-MS技术建立蛋白质波谱模型，并验证该模型在临床诊断中的敏感性和特异性，以探讨其在肿瘤早期诊断中的意义。本课题还应用此模型对胃癌诊断进行动态盲法检测，进一步验证其应用价值。同时对该组的部分胃癌病例进行双向凝胶电泳和差异蛋白的MALDI质谱分析，以期获得肿瘤特异表达蛋白，并对这两种实验方法进行比较。第一部分：胃癌蛋白质波谱模型的建立及在临床诊断中的应用目的：通过胃癌、慢性胃炎和正常人血清标本对比，采用SELDI-TOF-MS技术建立胃癌诊断的蛋白质波谱模型，检测并通过盲法验证所建立的蛋白波谱模型对胃癌的诊断价值。材料：美国Ciphergen公司PBS-Ⅱ型SELDI-TOF-MS系统和SAX2(强阴离子交换)蛋白芯片。实验用血清来源，训练组：胃腺癌33例(经病理证实)，慢性胃炎30例(有上消化道症状、经胃镜检查及病理切片证实为慢性活动性胃炎)，健康对照31例(无消化道症状者，无既往胃疾病的病史和治疗史)；盲法实验组：胃腺癌15例、慢性胃炎10例、健康自愿者10例。方法：对训练组胃癌、慢性胃炎、健康对照血清做蛋白质波谱检测；Proteinchip 3.0分析，寻找组间差异表达的蛋白质峰；对差异表达的P＜0.01的所有蛋白质峰进行分析；选出最佳排列组合；输出原始判别和交叉验证的结果，选出最佳诊断蛋白质组模型。用建立的蛋白质谱模型对盲法实验组35例未知的血清标本(包括胃腺癌患者、胃炎患者与健康人)进行盲法预测，验证该模型。结果：胃腺癌组与正常人组比较，训练组：对33例胃癌和31例健康对照者样本检测质谱图比较，得到蛋白质峰为45个，其中5910Da、5084Da、8691Da这三个蛋白质峰组合差异最大。胃癌病例血清表达5910Da蛋白质比正常人高，5084Da峰旁出现二联峰或三联峰，其峰的高低与肿瘤的分化恶性程度正相关，8691Da峰值低于正常人。用该方法检测胃癌的灵敏度为90.91％(30／33)，特异性为93.55％(29／31)，阳性预测值为93.75(30／32)。盲法组：用上述三个蛋白质峰组成的蛋白质谱模型，对25例样本进行盲法测试，15例胃腺癌中14例被准确的检出，10例健康志愿者全部被准确的检出。其敏感性为93.3％(14／15)，特异性为100％(10／10)。胃腺癌组与胃炎组比较，训练组：对33例胃癌和30例健康对照者样本检测质谱图比较，共得到蛋白质峰为38个，其中5910Da、6440Da这两个蛋白质峰组合差异最大。而在5910Da峰胃腺癌的患者均比胃炎高，6440Da峰胃腺癌的患者则均比胃炎低，在胃腺癌和胃炎患者中5084Da峰均在峰旁出现二联峰或三联峰，可见该峰可能与胃损伤有关。利用这两个蛋白质峰数据建立蛋白质谱模型，用36例样本进行盲法测试，在15例胃腺癌中，14例被准确的检出，11例胃炎患者中有10例被准确的检出，其敏感性为93.3％(14／15)，特异性为90.9％(10／11)。结论：运用SELDI-TOF-MS技术，得出了胃癌患者不同于健康人的血清蛋白质指纹图谱，应用判别分析筛选出能达到最佳诊断效果的蛋白质峰组合并建立诊断模型，交叉验证结果较满意，其灵敏度和特异度均远高于现有的各种肿瘤标志物，具有一定的诊断价值，筛选出的差异表达蛋白质将可能成为新的候选肿瘤标志物。SELDI-TOF-MS技术在胃癌的诊断尤其是早期诊断和候选肿瘤标志物的筛选等方面具有一定的价值。第二部分：双向电泳-质谱技术筛选胃癌血清标记物目的：探讨胃癌患者血清中与胃癌发生、发展，以及手术治疗后相关的蛋白质表达差异，以期寻找肿瘤标志物。方法：用固相pH梯度二维电泳技术对胃癌患者手术前后和正常对照各2例的血清蛋白质进行电泳，硝酸银染色，通过2-DE图谱中蛋白质斑点的增减以及颜色的深浅筛选特异蛋白质斑点，AgfaDUOSCAN凝胶扫描分析，差异蛋白质点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其胶内酶解后的肽质指纹图谱，并查询SWISS2 PROT数据库筛选出该差异蛋白。结果：双向凝胶电泳显示，正常组和胃癌手术后组血清蛋白中有5个斑点与胃癌手术前组有显著差异。5个差异蛋白点进行胶内原位酶解，肽质指纹图谱分析成功得到了5个蛋白质肽质指纹图，并查询数据库初步鉴定了该5个蛋白质分别为Serpin B6(Placental thrombin inhibitor)(Cytoplasmic antiproteinase)(CAP)(Protease inhibitor6)(PI-6)；Septin-1(LARP)(Serologically defined breast cancer antigen NY-BR-24)；Kallikrein-6 precursor(Protease M)(Neurosin)(Zyme)(SP59)；Hemoglobin beta chain；Beta-defensin 108 precursor(Beta-defensin 8)(DEFB-8)。结论：成功的筛选出胃癌相关蛋白，该蛋白有望成为胃癌患者筛选的癌标记蛋白。第三部分：肝癌蛋白质波谱模型的建立及在临床诊断中的应用目的：通过肝癌、肝硬化和正常人血清标本对比，采用SELDI-TOF-MS技术建立可能用于肝癌诊断的蛋白质波谱模型，检测并验证所建立的蛋白波谱模型对肝癌的诊断价值。材料：美国Ciphergen公司PBS-Ⅱ型SELDI-TOF-MS系统和WCX2(弱阳离子交换)蛋白芯片，实验用血清来源：肝癌组40例(经B超、CT检查、血清AFP检测或手术后病理确诊为原发性肝癌)；肝硬化组46例(有症状、肝穿刺活检符合肝硬化诊断并经B超检查除外原发性肝癌的患者)；健康对照组60例(无消化道症状者，无既往肝病史，经超声肝脏检查无占位性病变，HBSAg阴性，肝功能正常范围的正常体检者)。方法：对肝癌、肝硬化、健康对照者血清做蛋白质波谱检测；Proteinchip 3.0分析，寻找组间差异表达的蛋白质峰；对差异表达的P＜0.01的所有蛋白质峰进行分析；选出最佳排列组合；输出原始判别和交叉验证的结果，选出最佳诊断蛋白质组模型并验证模型的应用价值。结果：肝癌组与健康志愿者组比较：对40例肝癌和60例健康志愿者检测到的质谱图进行分析比较，得到差异蛋白质峰为68个，其中发现4477Da、8943Da、5181Da、8617Da、13761Da具有显著性差异。且这5个蛋白质均为肝癌患者高于健康志愿者。通过4477 Da、8943 Da这两个蛋白质峰建立肝癌蛋白质谱模型可用于区分肝癌与健康志愿者，灵敏度为90％(18／20)，特异性为100％(60／60)。肝癌组与肝硬化组比较：分别对40例肝癌和20例肝硬化样本检测到的质谱图进行分析，得到差异蛋白质峰为46个，其中4477Da、13761Da、4097Da3个蛋白质峰具有显著性差异，在4477 Da、13761 Da峰处肝癌的患者均比肝硬化高，4097 Da峰处肝癌的患者均比肝硬化低，通过4477 Da这个蛋白质峰即可区分肝癌与肝硬化患者。同时发现肝癌、肝硬化、健康志愿者3者之间8943 Da，13761 Da蛋白质随着病情的出现及严重程度逐渐增加。肝硬化组与健康志愿组比较：分别对46例肝硬化和60例健康志愿者检测到的质谱图进行分析比较，得到差异蛋白质峰为85个，其中8943Da、13761 Da、4097 Da蛋白质峰具有显著性差异。同时肝硬化患者8943 Da和13761 Da峰均比健康志愿者高，而4097 Da峰均比健康志愿者低，通过这三个蛋白质峰即可区分肝硬化患者与健康志愿者。结论：运用SELDI-TOF-MS技术，得出了肝癌患者不同于肝硬化及健康人的血清蛋白质指纹图谱。应用判别分析筛选出能达到最佳诊断效果的蛋白质峰组合并建立诊断模型。交叉验证结果满意，其灵敏度和特异度均远高于现有的各种肿瘤标志物，具有较好的临床诊断价值。筛选出的差异表达蛋白质将有可能成为新的候选肿瘤标志物。SELDI-TOF-MS技术在肝癌的诊断尤其是早期诊断和候选肿瘤标志物的筛选等方面具有一定的价值。