论文部分内容阅读
蜜蜂蜂毒（honeybee venom or Bv，下称蜂毒）是重要的蜂产品和古今中外应用广泛的天然药物，具有重要的开发利用价值。蜂毒磷酸脂酶A2（BvPLA2）和透明质酸酶（BvHya）是蜜蜂蜂毒的2个主要功能性蛋白，是医学、细胞分子生物学研究等方面具有重要价值的有效药用成分和工具酶，也是具有杀虫和抗菌作用的生物活性成分。本论文开展了中华蜜蜂（A.cerana cerana,中蜂）、意大利蜜蜂（Apismellifera,意蜂）蜂毒磷酸脂酶A2和透明质酸酶基因的克隆与表达研究。 （一）中华蜜蜂和意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A2基因的克隆与表达 首先用RT-PCR方法克隆成功了中蜂蜂毒磷酸脂酶A2（AcPLA2）和意蜂蜂毒磷酸脂酶A2（AmPLA2）的成熟肽编码区基因，测序结果表明，二者的核苷酸序列全长均为405bp，所编码的多肽均为134氨基酸残基，推测二个多肽的分子量分别为14.7kD。对7种生物PLA2氨基酸序列联配结果，AcPLA2与AmPLA2、大蜜蜂PLA2、美国熊蜂PLA2及黑腹果蝇PLA2的同源性分别为95％、90％、54％、39％，AcPLA2与家猪胰PLA2和响尾蛇蛇毒PLA2的同源性均只有13％，表明AcPLA2与AmPLA2的同源性最高。从7种生物的PLA2分子系统树可见，AcPLA2与AmPLA2的进化距离最近。氨基酸序列分析结果表明，AcPLA2与AmPLA2具有相同的酶活位点、二硫键位点和Ca++结合位点，在分子结构与功能上反映出很高的同源性和保守性。AcPLA2属首次报道的基因序列，也是首个报道的中蜂基因序列，已作为新的基因序列在GenBank登录（登录号AF321087）。 将克隆到的AcPLA2与AmPLA2基因作EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后 浙江大学博士学位论文 中文摘要 pBacFastHTa 质粒的相应的多克隆位点中，获得重组杆状病毒供体质粒 pBacHT－AcPLAz和pBacHTAmPLA)然后分别转化大肠杆菌DH10Bac，经抗 生素和蓝白斑双重筛选，PCR 鉴定，获重组病毒B跳ffiid叭 和 Bacmid－AmPLAz。在无血清条件下，用 Lipofectin介导 Bacmid－AcPLAz禾 Bacmid Am P＊AZ的基因组0＊A转染生长状S《‘j态良好的粉纹夜蛾细胞TZ七B卜4后，分别 从被二者感染的Tn细胞抽提病毒DNA进行PCR检测，结果均得到与二者目的 基因大小一致的片段。SDS－PAGE 电泳结果表明，被 Bacmid－AcPLAz和 Bacmid－AmPLAZ感染的Tn细胞抽提物均有特异性蛋白条带。薄层扫描定量分析 结果表明，二者的特异性蛋白（表达量）分别占 Tn细胞总蛋白的 5．32％和 5．35 ％。用来源于意蜂蜂毒的AffiPLAZ（天然纯AffiPLAZ）作抗原免疫家兔，获得了 效价很高的多克隆抗体，以此多克隆抗体作为一抗进行 Western blot检测， ACPLA。和 AInPLAZ的表达产物均具有很强的免疫活性，在约 18 kD处与天然纯 AJTIPLAZ同样有明显的阳性条带，与预期目的蛋白分子量大小一致。用蛋黄③ 磷脂)作底物作生物活性测定，二者的表达产物均显示类似于天然纯AmPLA。 及意蜂蜂毒的PLAZ酶活活性。这是ACPLAZ和AmPLAZ基因在杆状病毒－昆虫细 胞表达系统中的首次成功表达。 通过PCR分别从pGEM－ACPLAZ和pGEM－AInPLAZ获得目的基因，经低熔 点凝胶回收纯化后，分别用平末端克隆策略插入pETBlueq载体，构建成大肠杆 菌表达载体 pET－AcPLAz和 pET－AmPLA。，并在 Tuner（DE3）plac菌株中进 行了诱导表达。二者的表达产物在SDS－PAGE中均呈特异性条带，薄层扫描定 量分析结果，H者的特异性条带蛋白（表达量）分别占菌体总蛋白的4．61％和 4．320。ACPLA。和 AinPLAZ基因的表达产物经wCStCffi bio0均具有很强的免 疫活性，在约15kD处均与天然纯AmPLA。同样有明显的阳性条带，与预期目的 蛋白分子量大小一致。这是A。PLAZ基因在大肠杆菌中的首次成功表达，也是对 非人工合成的AZPLAZ基因在大肠杆菌中的首次成功表达。 （二）中华蜜蜂和意大利蜜蜂峰毒透明质酸酶基因的克隆与表达 首先用RT干CR方法克隆成功中蜂蜂毒透明质酸酶（AcHya）基因和意蜂蜂 区！互 ) 浙江大学博士学位论文 中文摘要 毒透明质酸酶（AmHya）基因，测序结果，二者的核苦酸序列全长分别为门 64 hp 和＊ 49 hp，可分别编码 387个氨基酸残基和 384氨基酸残基的多肽，推测二个多 肽的分子量分别为 42．5 kD和 42刀 kD。对 7种生物的 Hya氨基酸序列联配结果， AcHya与 AJTIHyffi gi