论文部分内容阅读
研究背景:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,多种基因变异与HCC发生相关。EZH2(enhancer of zeste homolog 2)是果蝇zeste基因增强子的人类同源基因,为Polycomb group基因家族的重要成员之一。Ploycomb group(PcG)和Trithorax group(trxG)都是进化过程中保守的染色质修饰基因,通过PcG和trxG蛋白的相互拮抗作用,维持同源异型基因的沉默和活化状态,其中PcG维持同源异形基因的失活状态,trxG蛋白则维持基因的激活状态。近年来,EZH2在多种肿瘤中高表达,具有促进细胞增殖,肿瘤细胞扩散的作用。近几年来,一类小分子对基因表达的调控作用引起了广大生物研究者的关注,即microRNA (miRNA)。miRNA是一类长度在19~24个核苷酸左右的进化保守的内源性非编码小分子RNA,在动植物中成为一类基因调控子。依据与靶mRNA的互补程度不同通过两种方式负调节靶基因的表达。当miRNA与靶mRNA完全互补结合,作用方式和功能与RNAi (RNA-mediated interference)非常类似,由miRNA相关的多蛋白RNA介导的沉默复合物(the miRNA-associated, multiprotein RNA induced-silencing complex,miRISC)切割靶mRNA,引起靶基因mRNA的降解,这一机制在植物当中比较普遍。然而,大部分动物miRNAs则是通过另一种不牵涉它们的靶mRNA断裂的机制来发挥作用。这些miRNAs与它们的靶mRNA 3′-UTR区以不完全互补的方式结合,在转录后抑制靶基因的翻译,通过这种机制miRNAs降低了靶基因蛋白的表达水平,但该基因的mRNA水平几乎不受影响。近来的研究结果表明,miRNA突变和异常表达与各种人体肿瘤发生、发展相关,miRNA能抑制多种重要肿瘤相关基因的表达,可作为癌基因或抑癌基因而起作用。深入研究miRNA在人体肿瘤中的表达状况及其功能,对研究肿瘤的发生、发展和转移的机制具有重要意义,并将有利于肿瘤的诊断、治疗及预后判断。目的:检测EZH2和miR-101在HCC中的表达,探讨miR-101对EZH2表达的调控及其意义。方法:1.采用本课题组收集的广西医科大学一附院2005年12月-2006年9月期间经病理确诊的HCC患者42例,取其肝癌组织及其癌旁组织,9例血管瘤患者的瘤旁组织作为正常对照。采用RT-PCR方法检测EZH2 mRNA在肝癌、癌旁及正常组织中的表达情况,分析EZH2 mRNA与HCC临床病理特征的关系。2.采用免疫组织化学方法检测EZH2蛋白在肝癌、癌旁及正常组织中的表达情况,分析EZH2蛋白与HCC临床病理特征的关系。3.选用国内外最常用也是最权威的三个miRNA预测软件:miRanda,PicTar和Targetscan,预测与EZH2 mRNA 3′-UTR有互补结合位点的miRNA。4.用Trizol提取总RNA,采用EzomicsTM miRNA q-PCR Detection Primer Set、Real Master Mix(SYBR Green) ,以U6snRNA作为内参,进行实时荧光相对定量RT-PCR,测定18对肝癌及癌旁组织中成熟miR-101的转录水平。5.应用Western-blot方法检测18对肝癌及癌旁组织中EZH2蛋白表达情况。结果:1. RT-PCR检测42例肝癌组织EZH2 mRNA阳性率为61.9%(26/42),相对应的癌旁组织阳性率为28.6%(12/42);正常肝组织阳性率为22.2%(2/9)。三组比较有显著差异(P<0.01),其中EZH2 mRNA在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.05)和正常肝组织(P<0.05),癌旁组织与正常组织比较,差异无统计学意义(P>0.05)。EZH2 mRNA在肝癌组织中的阳性表达率与HCC分化程度有关(P<0.05),在低分化组的表达高于高-中分化组,而与肿瘤大小、HBV感染、AFP水平、肝内外转移以及是否伴有肝硬化无明显相关(P>0.05)。2.免疫组化检测EZH2蛋白在肝癌中的阳性率为59.5%(25/42),明显高于癌旁21.4%(9/42)及正常肝组织22.2%(2/9)。三组比较有显著差异(P<0.01),其中,EZH2蛋白在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.05)和正常组织(P<0.05),癌旁组织与正常组织比较,差异无统计学意义(P>0.05)。EZH2蛋白在肝癌组织中的阳性表达率与肿瘤大小、分化程度、HBV感染、AFP水平、肝内外转移以及是否伴有肝硬化无明显相关(P>0.05)。3.三个软件TargetScan、miRanda和PicTar均预测到miR-101与EZH2 mRNA 3′-UTR有2个互补结合位点,提示EZH2 mRNA为miR-101的靶mRNA。4.在18对肝癌及癌旁组织中均检测到miR-101,癌组织miR-101转录水平明显低于癌旁组织(0.34±0.18vs1.00±0.00),差异显著(P<0.01)。5.在所检测的18对肝癌及癌旁组织均有EZH2蛋白表达,癌组织EZH2表达量明显高于癌旁组织(0.90±0.30vs0.36±0.21),有显著性差异(P<0.01=。结论:1. EZH2在肝癌组织中呈较高表达,尤其在低分化肝癌中表达更高,提示EZH2在肝癌的发生发展中起重要作用。2.生物信息学预测EZH2 mRNA为miR-101的靶mRNA。3. miR-101在肝癌组织中的转录水平明显低于癌旁组织;而EZH2在肝癌组织中的蛋白表达量明显高于癌旁组织,两者呈负相关关系,验证了EZH2为miR-101的靶基因,受miR-101负调控。