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分子印迹技术(Molecularly imprinted technique,MIT)是一类模拟抗原-抗体相互作用原理,采用人工方法合成对模板分子具有专一性结合能力聚合物的技术。而抗原表位分子印迹(epitopeimprinting)是最近几年发展起来的一种应用前景较好的分子印迹技术。该方法借鉴生物体中抗体在识别抗原时只需要与抗原的某一特定部分,即抗原决定簇发生作用,即可识别整个抗原的原理,合成的分子印迹聚合物既可以对该抗原表位代表的多肽,又可以对含有该抗原表位的生物大分子具有特异性识别能力,应用在蛋白质分子印迹领域,可以解决蛋白质构象多变,价格昂贵,结合位点过多等缺点,应用前景较好。Bt蛋白是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在芽孢形成过程中产生的一类具有特异性杀虫毒性的蛋白质伴孢晶体,可以通过转基因植物残体、根系分泌物等途径进入土壤生态系统,并与矿物以及腐殖质等牢固结合,长时间保持杀虫活性,影响土壤生物多样性和生态学过程,从而产生巨大的生态风险。因此,对生态系统中Bt蛋白释放、迁移的监控是十分必要的。BtCry1Ac蛋白是Cry家族中的重要一员,其抗原决定区中的Domain Ⅱ loop 2位于晶体结构的最顶端,该抗原表位代表的氨基酸序列几乎完全暴露在外。鉴于此,本文以BtCry1Ac蛋白抗原表位Domain Ⅱ loop 2代表的多肽368RRPFNIGINNQQ379(RQ-12)为模板,以丙烯酰胺修饰碳纳米管为基质,以异丙基丙烯酰胺(NIPAm)、丙烯酸(AAc)、1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([AMIM][PF6])等为功能单体,N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(NNMBA)为交联剂,过硫酸铵(AP)和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)为引发剂和催化剂,采用自由基引发聚合法(free radical polymerization)和表面分子印迹技术合成Bt蛋白抗原表位分子印迹聚合物,并对影响分子印迹效果的条件进行了优化,对材料的表面形貌、选择性和特异性等进行了评价,主要内容如下:(1)在丙烯酰胺修饰碳纳米管表面接一层preMBA,以降低分子印迹聚合物形成过程中丙烯酰胺修饰碳纳米管自身对模板分子的不可逆吸附,并对preMBA的加入量进行了优化,经过性能评价,将preMBA定为20mg。后续如无特别说明,均将丙烯酰胺修饰碳纳米管表面接枝20mgMBA,然后再合成分子印迹聚合物。(2)在超纯水体系中,以RQ-12为模板分子,以NIPAm,[AMIM][PF6]、以及AAc和NIPAm的混合物作为功能单体,以MBA作为交联剂,采用表面分子印迹技术制备RQ-12分子印迹聚合物,然后以10%AcOH(v/v)溶液对模板分子进行洗脱。在该体系中,使用单一或者混合功能单体,对各组分的含量进行优化,均无明显印迹效果,这可能是因为在该体系中功能单体和模板多肽之间形成的作用力较强,采用10%AcOH(v/v)溶液作为洗脱剂对模板多肽的洗脱效果不理想。(3)在超纯水体系中,以RQ-12为模板分子,以亲水性NIPAm为功能单体,以MBA为交联剂,合成表面分子印迹聚合物。对洗脱条件进行了优化,结果发现以SDS-AcOH混合溶液为洗脱剂,能够洗脱出更多的模板分子,形成更多的印迹空穴,提高分子印迹聚合物的印迹效果。对模板分子及交联剂的含量进行了优化,其最佳合成条件为RQ-12 18mg,NIPAm120mg,MBA1OOmg。对分子印迹聚合物的吸附条件进行了优化,结果发现,pH值为5.5时吸附容量和印迹效果最佳,其对模板RQ-12的吸附量可达218.76mg/g,印迹因子为1.39。合成抗原表位分子印迹聚合物对AE-9,FS-11,RQ-12,FR-14,RQ(O),NK-12等六种不同的多肽分别进行吸附实验,结果发现该材料对RQ-12的印迹效果最好,而对其他几种多肽均无明显的印迹效果。将AE-9、FS-11、RQ-12、FR-14和RQ-12(O)五种多肽混合在一起进行竞争性吸附实验,结果发现合成的抗原表位分子印迹聚合物对RQ-12的印迹因子可以达到2.14,而对其他多肽均无明显印迹效果。以上研究表明合成的抗原表位分子印迹聚合物对Bt蛋白抗原表位代表的多肽具有较好的印迹效果和选择性吸附能力。(4)考察上述(3)合成的抗原表位分子印迹聚合物对目标BtCry1Ac蛋白的吸附容量、印迹效果和选择性,结果发现:在pH 8.9和9.9的碱性条件下,该抗原表位分子印迹聚合物对BtCry1Ac蛋白具有稳定的印迹效果。与BSA、BHb、HSA、LZM和Try等蛋白相比,其对BtCry1Ac蛋白的印迹效果最好,体现出对Bt蛋白较强的选择性吸附能力。最后,采用分子印迹和空白分子印迹聚合物对苏云金芽孢杆菌培养液中的BtCry1Ac蛋白进行了纯化,采用SDS-PAGE对吸附后及洗脱后溶液进行了分析,结果发现该分子印迹聚合物对BtCry1Ac蛋白的吸附容量更大,其洗脱液中BtCry1Ac蛋白的纯度较高,洗脱总量更大,证实在实际样品中,该分子印迹聚合物对BtCry1Ac蛋白也表现出较强的选择性。