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猪痘(Swinepox)是由猪痘病毒(Swinepox virus, SWPV)引起猪的一种温和或急性传染病,以皮肤发生红斑、丘疹、脓疱和结痂为特征,主要危害3月龄以内的猪,成年猪很少发生或症状轻微,也有关于猪痘病毒胎盘感染导致流产、死胎或初生仔猪发病的报道,呈世界性分布。猪痘可通过猪虱等的叮咬机械传播,与猪的饲养卫生条件差相关。由于猪痘给养猪业造成的直接损失较小,通常被忽视。本试验通过猪痘病毒的分离及其分子流行病学和血清学调查,旨在了解江西地区猪群中猪痘病毒的感染情况,为今后开展猪痘的流行病学、病毒的生物学特性、猪痘病毒作为表达载体等的研究打下基础。1.猪痘病毒PCR检测方法的建立与应用根据GenBank上登录的猪痘病毒(登录号：AF410153.1)P35基因序列,设计并合成1对引物,扩增目的片段为975bp。以疑似猪痘的皮肤痘痂提取DNA,通过对反应条件的优化,建立了检测猪痘病毒PCR方法。特异性、重复性和敏感性试验表明,该方法特异性高、重复性良好、对模板的最低检测量为2.7×10-8μg。以建立的PCR检测方法对收集自江西地区的55份疑似猪痘保育猪皮肤痘痂进行PCR检测,结果有44份为猪痘病毒阳性,阳性率为80%,表明江西省猪群存在猪痘病毒感染。2.猪痘病毒分离及P35基因的同源性分析以PCR检测为猪痘病毒阳性的保育猪皮肤痘痂为病毒分离材料,采用PK15细胞盲传方式进行猪痘病毒的分离,通过对PK15细胞培养物进行猪痘病毒P35基因的PCR扩增和测序确定病毒分离的成功。从江西省分离到15株猪痘病毒,分别命名为SWPV-JX01～SWPV-JX15。所有分离毒株在PK15细胞上均不产生明显的CPE,感染的PK15细胞均能连续传代,仅造成死细胞偏多、胰酶消化时间缩短。以分离株SWPV-JX07人工感染兔和小鼠试验,表明能在兔体内增殖,不能在小鼠体内增殖。通过对分离毒株P35基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行同源性比较分析,结果表明：(1)分离毒株间的核苷酸序列同源性为98.1%～100%,推导氨基酸序列同源性为98.2%～100%；(2)分离毒株与猪痘病毒(AF410153.1)的P35基因核苷酸序列同源性为96.6%-98.2%,氨基酸序列同源性为87.5%～88.5%。3.猪痘病毒P35基因的原核表达将猪痘病毒P35基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-P35,转化入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表明,表达产物分子量约为64kDa(GST蛋白26kDa,P35蛋白约38kDa),与预期大小一致；通过蛋白纯化和浓度测定,获得浓度约700μg/mL P35重组蛋白；以纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠(70μg/次·只),连续免疫三次后采血,抗体效价达到1：102400,表明该P35重组蛋白具有良好的免疫原性。4.猪痘病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及江西地区猪痘病毒血清学调查以P35重组蛋白为检测抗原包被96孔酶标板,建立了检测猪血清中猪痘病毒抗体的间接ELISA方法,该方法的最佳包被抗原浓度为10μg/mL,猪血清最佳稀释度为1：80,兔抗猪IgG酶标二抗的稀释倍数为1：5000。以建立的ELISA方法对2006年-2012年江西地区258个养猪场的2530猪血清样品进行猪痘病毒抗体检测,结果1045份为猪痘病毒抗体阳性,血清总阳性率为41.3%(1045/2530)；猪场阳性率为90.7%(234/258)；其中母猪、哺乳仔猪、保育猪和生长育肥猪的阳性率分别为46.1%(749/1625)、16.9%(40/236)、38.3%(175/457)和37.7%(80/212),母猪群的猪痘病毒抗体阳性率最高。本实验结果表明江西地区猪群中存在较普遍的猪痘病毒感染。