基于整合子—基因盒系统的胃肠道革兰阴性细菌耐药机制研究

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目的:了解H.pylori对呋喃唑酮的耐药率,探讨其耐药机制;考察消化系统分离的临床常见革兰阴性细菌整合酶的流行状况;分析整合子的种类、结构特征和分布,探讨其在宿主菌抗生素耐药及多重耐药中的作用;通过E.coli整合子的检测和染色体DNA的脉冲场电泳分析等,寻找消化系统常见细菌耐药性传播的途径与可能机制,增强临床医生抗生素正确、合理的使用意识。 结果:1.46株H.pylori临床分离菌中有4株对呋喃唑酮耐药,耐药率为8.7%,以低水平耐药为主,未见有高水平耐药。PCR扩增porD和oorD基因,产物大小为592bp和458bp。基因测序后发现,呋喃唑酮耐药H.pylori临床分离株中,porD基因有三个位点的突变,分别是C357T、A356G、G353A,但以C357T最为常见,而中度敏感的菌株中也发现了基因的突变C357G;oorD基因也有三个位点的突变,分别是A041G、A122G、C349A(G),在349位既有C→A又有C→G突变,但是都导致了天冬酰胺被赖氨酸代替。H.pylori对呋喃唑酮耐药性的诱导未获成功。 2.临床分离的胃肠道革兰阴性细菌三类整合酶的阳性率差异较大,Ⅰ类整合酶的阳性率为43.2%、Ⅱ类和Ⅲ类整合酶的阳性率分别为49%和2%,以E.coli Ⅰ类整合酶的阳性率为最高,达61%。 3.PCR扩增整合酶阳性的临床分离株Ⅰ类整合子,测序后发现共有5种不同基因盒,分别为:dfrA17、aadA5、aad4Al、aadA2、dhrfXI。有4种不同的整合子基因盒排列方式大小在1500~2000bp左右,E.coli中共检测到89株细菌含有Ⅰ类整合子,绝大多数整合子的排列方式为:dfrA17-aadAS,仅有一株细菌排列方式为aadAl;而肺炎克雷伯菌中仅有1株含有基因盒,其排列方式为aadA,鲍曼不动杆菌共检测到4株含有整合子,其基因盒排列方式为:dhrfXI-aadA2;阴沟肠杆菌中检测到一株含有整合子,其基因盒排列方式与E.coli基因盒的排列方式相同。 4.89株整合子阳性的E.coli中21株产超广谱β内酰胺酶。 5.在整合子阳性的E.coli中,有10株在Ⅰ类整合子第一个3’保守区域后检测到orf513、orf 3-like、 IS3000和orf5基因,但在这10株中,仅有5株在orf513基因的下游检测到blaCTX-M-1基因,首次报道了分离于人E.coli菌株中检测到ISCR1相关的含有blaCTX-M-1基因复杂Ⅰ类整合子。PFGE分析blaCTX-M-1基因相关的含有复杂Ⅰ类整合子的E.coli发现,zj102和zj562两株源于同一克隆。 结论: 1.镇江地区H Pylori临床分离株对呋喃唑酮的耐药率较低,而且以低水平的耐药为主,H Pylori菌对呋喃唑酮的耐药可能与porD和oorD基因的突变有关。 2.镇江地区流行的整合子以Ⅰ类整合子为主,其中E.coli整合子检出率为高。分析其可变区基因盒结构发现,这些耐药基因盒主要编码甲氧苄啶耐药和链霉素、壮观霉素耐药的两大基因家族。 3.镇江地区存在复杂Ⅰ类整合子的流行,这些复杂Ⅰ类整合子主要与ISCR1基因相关,可能系超广谱β-内酰胺酶的广泛使用所致,而且脉冲场电泳结果提示,在镇江地区存在着单克隆耐药株传播的可能性。 4.镇江地区耐药基因在传播方式上既有水平传播(阴沟肠杆菌与E.coli具有相同的基因盒排列方式),又有垂直传播(PFGE发现有同一单克隆的遗传)。
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