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目的应用脑立体定位技术在大鼠海马CA3中心区通过微量注射海人草酸(Kainate),建立颞叶癫痫大鼠模型,以此模型为基础,从行为学、形态学和分子生物学等方面观察颞叶癫痫大鼠痫样自发发作频率、海马神经元存活情况、苔藓纤维发芽(Mossy fibres sprouting, MFS)及海马内海人草酸受体(kainate receptor, KAR)蛋白表达水平,以此评价白藜芦醇(Resveratrol,Res)对Kainate诱导颞叶癫痫大鼠的抗癫痫效果并分析其作用机制。方法1.模型建立雄性Wistar大鼠,体重220～250克,清洁级。用脑立体定位技术在大鼠海马CA3区(AP:- 4.0 mm,ML:- 4.4 mm,DV:3.8 mm)缓慢注射Kainate 2.5μl(0.4μg/μl),约10 min注射完毕,留针3~5 min,缝合头皮。按Racine分级法对癫痫发作程度进行分级,发作级别达4级以上的大鼠用于下一步实验。对照组大鼠在同样的脑区注射等量的生理盐水。2.动物分组将实验动物分为三组:正常生理盐水假手术组(NS组)、癫痫模型组(Kainate组)和kainate + Res治疗组(Res组,15 mg/kg/d)。癫痫大鼠在首次急性大发作后即通过灌胃给药,每天1次,持续10天。3.行为学观察将手术后的大鼠饲养于装有视频监控的动物房内,自然采光,室温维持在23°C±1°C,所有大鼠自由进食饮水。对各组大鼠进行视频监控,每天监控8小时,每周监控5天,共监控2个月,从行为表现上统计各组大鼠两周后发生癫痫自发发作的个体数。4.形态学分析行为学观察完毕后,对大鼠进行内灌注取脑,组织经脱水处理后进行冰冻切片,片厚20μm,并进行Nissl和Timm染色,Nissl染色用以评价各组大鼠海马内CA1、CA3和齿状回(dentate gyrus,DG)门区神经元的损伤情况;Timm染色用以评价各组大鼠MFS的程度。5. Western blot分析7%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后立即断头取脑,冰上小心分离出海马,置于EP管中经- 80°C冻存。用脑组织蛋白裂解液提取海马内全蛋白,利用BCA法测蛋白浓度。取样本于10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,蛋白80 V恒压湿转入PVDF膜上,5%脱脂牛奶室温封闭30 min,孵一抗4°C过夜,0.05% PBS-T洗膜3×10 min,室温共同孵育二抗和HRP-GAPDH抗体1.5 h,0.05% PBS-T洗膜3×10 min,暗室中ECL显色后曝光。6.统计学分析采用SPSS 13.0软件进行统计分析,各组大鼠之间的痫样自发发作率用x2检验比较;组间差异使用单因素方差分析,组内差异使用post hoc法比较。统计数据以x±s表示,p < 0.05具有统计学差异。结果1.行为学观察颞叶癫痫模型的成功率达到97.0%(31/32)。NS组未见自发性癫痫发作;Kainate组大鼠自发发作率为75.0%(9/12);Res组大鼠的自发发作率为14.3%(1/7)。2.形态学检测Nissl染色结果显示Res对海马CA1区神经元具有保护作用,同时对CA3a区也有显著保护作用(p < 0.05),但对CA3的其他区域和DG门区的神经元无明显的保护作用。Timm染色结果显示kainate组大鼠苔藓纤维侵入颗粒细胞层和内分子层。而NS组未观察到神经元的丢失和MFS。Res对kainate组大鼠MFS具有明显的抑制作用(p < 0.05)。3. Western blot分析Kainate诱导颞叶癫痫后大鼠海马区海人草酸受体(kainate receptor,KAR)蛋白表达明显增加,而经过Res灌胃治疗后,KAR蛋白表达量显著降低(p < 0.05),与NS组大鼠相比较无明显差异。结论1. Res显著抑制kainate诱导的颞叶癫痫大鼠的痫样自发发作,对颞叶癫痫的发生和发展具有一定的抑制效果。2. Res对kainate诱导的颞叶癫痫大鼠海马CA1和CA3a区锥体细胞具有显著的保护作用,同时能抑制MFS。3. Res显著抑制kainate诱导的颞叶癫痫大鼠海马内KAR蛋白的表达,其抗癫痫作用可能是通过抑制了癫痫大鼠海马区KAR的表达实现的。