哺乳动物乳腺组织在哺育下一代时分泌乳汁为其成长提供营养以及免疫保护,乳汁中的主要成分包括乳蛋白、乳脂肪、乳糖等,牛乳也是人类生活中必不可少的优质食品。乳合成相关的信号转导通路、调控乳合成的关键信号分子及其作用机制是畜牧学亦是生命科学研究的重要内容。PURB是Pur蛋白家族中成员,Pur家族蛋白可以形成同型和异型复合物,并且特异性地以高亲和力结合富含嘌呤的ssDNA(有义或反义)或RNA。它们优先结合含有GGN(N不是G)重复序列。本研究前期发现当蛋氨酸(Met)刺激时牛乳腺上皮细胞(BMECs)PURB表达量显著增加,提示PURB作为转录因子可能对BMECs的乳的合成起调控作用。目前,国际上有关PURB的功能和作用机制的研究较少,尚无研究揭示PURB对BMEC乳合成是否发挥作用。本实验拟揭示PURB在氨基酸促进BMECs乳蛋白和乳脂肪合成中的作用及其分子机理。本研究通过组织块法培养和纯化BMECs,得到的原代BMECs进行传代培养,-80℃冻存备用。倒置显微镜下观察细胞形态和生长速度,免疫荧光(IF)法鉴定细胞的纯度:检测细胞中β-酪蛋白(β-casein)和角蛋白18(Cytokeratin 18)的表达。在培养液中添加0.6 mmol/L Met或0.6 mmol/L Leu,qRT-PCR和western blotting实验结果表明α-casein和β-casein表达量显著提高。脂滴实验结果与甘油三酯(TG)检测实验表明,Met和Leu能够显著促进BMECs乳脂肪的合成。通过以上实验成功地建立了氨基酸调节乳合成的体外细胞培养模型。qRT-PCR和western blotting结果表明PURB蛋白和mRNA的表达量在Met和Leu作用时显著上升。IF检测PURB的亚细胞定位,显示PURB定位在胞核中,Met、Leu处理增强PURB在胞核中的定位。这些结果表明,Met和Leu能够显著促进BMECs中PURB的表达和核定位,提示在Met和Leu上调乳蛋白和乳脂肪合成的过程中,PURB可能是一个重要的调节因子。利用重组质粒和siRNA对PURB基因进行过表达和干扰。PURB基因过表达时,PURB、α-casein和β-casein表达量显著提高,TG分泌和脂滴的合成显著提高,mTOR磷酸化和SREBP-1c蛋白水平也显著提高;PURB基因干扰时,PURB、α-casein及β-casein表达量显著降低,TG分泌和脂滴的合成显著降低,mTOR磷酸化和SREBP-1c蛋白水平也显著降低。以上研究结果表明,PURB具有正向调节mTOR和SREBP-1c信号分子从而促进乳蛋白和乳脂肪合成的作用。为了探究PURB接受Met和Leu刺激从而调节乳合成的分子机制,应用PI3K抑制剂沃曼青(wortmannin)抑制PI3K信号通路。Western blotting分析表明PI3K抑制完全阻断了2种氨基酸对PURB表达的促进作用。结果表明Met和Leu通过PI3K途径促进PURB蛋白表达。为进一步探究PURB是否介导Met和Leu调节mTOR和SREBP-1c信号分子,细胞添加Met或Leu时同时转染PURB siRNA。Western blotting分析表明PI3K抑制完全阻断了两种氨基酸对mTOR磷酸化和SREBP-1c蛋白水平的促进作用。结果表明PURB介导Met和Leu调节mTOR和SREBP-1c信号途径。采用染色质免疫共沉淀(ChIP)-PCR和ChIP-qPCR鉴定PURB与mTOR、SREBP-1c基因的启动子(-1~-2 000bp)可能发生结合的位点。结果发现PURB与mTOR、SREBP-1c基因的启动子各存在一个结合位点。ChIP-qPCR结果显示,Met和Leu刺激促进PURB与靶基因启动子的结合。PURB基因过表达和干扰发现PURB正向调节mTOR和SREBP-1c的mRNA水平。这些实验结果表明Met和Leu刺激PURB表达并促进与PURB与mTOR、SREBP-1c的基因启动子结合,启动基因转录。已有研究提示PURB在基因转录中起着关键作用,但与许多其他转录因子相比,国际上发表的结果较少。本研究发现在BMECs中,PURB是牛乳腺细胞中乳蛋白和乳脂肪合成的正向调控因子。PURB位于细胞核,氨基酸(Met和Leu)通过PI3K信号途径促进PURB表达。PURB可以与mTOR和SREBP-1c基因启动子结合促进其转录,Met和Leu刺激这种结合。PURB介导Met和Leu对mTOR和SREBP-1c表达的刺激,导致乳蛋白和乳脂肪合成增加。综上,在BMECs中PURB介导Met和Leu信号促进mTOR和SREBP-1c基因转录从而促进乳蛋白和乳脂肪合成。