柴胡皂苷是中药柴胡的主要生物活性成分,其母核结构为齐墩果烷型五环三萜类,具有解热、镇痛、镇静、抗肿瘤等药理作用;文献报道其中以柴胡皂苷A（saikosaponin A,SSA）、柴胡皂苷B1（saikosaponin B1,SSB1）、柴胡皂苷B2（saikosaponin B2,SSB2）、柴胡皂苷D（saikosaponin D,SSD）含量较高。但是,这些原生苷由于分子量和极性较大,在小肠内吸收较差,不利于发挥药效,而转化成前柴胡皂苷或者苷元后,极性降低,在小肠内能够更好地被吸收从而发挥更好的药性。制备前柴胡皂苷常用的方法有酸水解法、微生物转化法和酶水解法。传统的酸水解法产生的酸废水会对环境造成不利影响,且柴胡皂苷易被水解生成柴胡皂苷元和其他副产物;微生物转化法发酵过程耗时且难以控制,操作繁琐;酶水解法具有反应条件温和、高专一性和高效性的特点,已被广泛应用于多种皂苷的转化反应。本论文构建并优化了酶水解获取系列稀有前柴胡皂苷的关键技术;此外,研究了β-D葡萄糖苷酶的重组表达,并对重组酶的酶学性质进行了表征,为进一步通过固定化酶水解柴胡皂苷并获取前柴胡皂苷奠定基础。本论文研究内容主要包括以下三个部分:1、酶水解柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2获取前柴胡皂苷A和前柴胡皂苷D的研究。首先利用高效液相法建立柴胡皂苷B1、柴胡皂苷B2、前柴胡皂苷A和前柴胡皂苷D的含量测定方法;然后以原生苷的转化率为指标,比较β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖苷酶、纤维素酶、柚苷酶或蜗牛酶对柴胡皂苷B1/B2的转化效果,选择最优酶,进而采用单因素和响应面实验设计对酶水解条件进行优化,并将所建立的技术应用于获取前柴胡皂苷A和前柴胡皂苷D;最后采用制备高效液相法对其进行纯化,并利用LC-MS、~1H-NMR、13C-NMR确定产物的化学结构。结果表明,柴胡皂苷B2的最佳水解酶为纤维素酶,当酶/底物质量比为80:1（mg:mg,w/w）、酶解时间为33 hrs、反应温度为60°C、缓冲液p H为4.7时,柴胡皂苷B1的转化率可达95.0%;柴胡皂苷B1的最佳水解酶为蜗牛酶,当酶/底物质量比为30:1（mg:mg,w/w）、酶解时间为33 hrs、反应温度为56°C、缓冲液p H为4.5时,柴胡皂苷B1的转化率高达99.1%。由此可见,本研究所构建的酶水解体系能够较为高效、经济地获取两种稀有前柴胡皂苷,为大量制备前柴胡皂苷A和前柴胡皂苷D奠定了基础。2、酶水解柴胡皂苷A和柴胡皂苷D获取前柴胡皂苷F和前柴胡皂苷G的研究。首先建立了柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、前柴胡皂苷F和前柴胡皂苷G的HPLC分析方法;然后以原生苷的转化率为指标,进而采用单因素和响应面实验设计对酶水解条件进行优化,并采用高效液相制备技术对其产物进行纯化,最后利用LC-MS、~1H-NMR、13C-NMR确定产物的化学结构。结果表明,当蜗牛酶/柴胡皂苷A质量比为44:1（mg:mg,w/w）、酶解时间为12 hrs、反应温度为39°C、缓冲液p H为6.0时,柴胡皂苷A可以完全转化为前柴胡皂苷F;当蜗牛酶/柴胡皂苷D质量比为70:1（mg:mg,w/w）、酶解时间为14 hrs、反应温度为37°C、缓冲液p H为5.5时,柴胡皂苷D的转化率高达99.2%。由此可见,本研究所构建的酶水解体系能够较为高效、经济地获取前柴胡皂苷,为大量制备前柴胡皂苷F和前柴胡皂苷G奠定了基础。3、重组β-D-葡萄糖苷酶的表达及其酶学性质表征。首先合成β-D-葡萄糖苷酶基因,并将其插入质粒p PIC9K,电转至P.pastoris GS115中,并进行抗G418筛选;然后对培养基诱导产重组β-D-葡萄糖苷酶条件进行优化。结果表明,当培养基初始p H值为6.0,甲醇添加量为1.5%（v/v）,诱导培养6 d后,该酶的表达量最高。在其酶学性质表征研究中,重组β-D-葡萄糖苷酶的最适缓冲液的p H为6.0,最适的反应温度为50°C,1 m M K+和5 m M Fe3+对酶活有轻微激活作用,Cu2+和1 m M Mg2+则对酶活具有明显的抑制作用;SDS对重组酶具有较明显的抑制作用,Tween-80和β-ME对酶活有轻微的抑制作用,且随着浓度的升高,抑制作用增加。该重组酶对甲醇的耐受性较好,在10%甲醇中相对酶活仍保持80%以上。重组β-D-葡萄糖苷酶对葡萄糖具有很高的耐受性,即该酶活力受产物的反馈抑制影响较小。以p NPG为底物时,重组β-D-葡萄糖苷酶的米氏常数Km为2.43m M,最大反应速率Vmax为3.71μM/min。底物特异性研究显示,该酶对柴胡皂苷A、B1、B2、D末端的葡萄糖均有较好的水解作用,该部分研究为重组β-D-葡萄糖苷酶循环利用于水解柴胡皂苷,并更为高效地获取稀有次级苷奠定了基础。