温度是影响水生动物多种生命活动包括生长、发育、繁殖、代谢及地理分布等的重要影响因子。本文以红螯光壳螯虾(Cherax quadricarinatus)为研究对象,该虾具有抗逆性强、生长速度快、耐低氧能力强等养殖优势,近年来在很多亚热带国家和地区引入养殖。然而,作为温水养殖经济物种,红螯光壳螯虾的最适生长温度是24-30℃,当温度低于10℃时出现生长停滞和停止蜕壳等现象,且存活率也受到影响,这严重限制了红螯光壳螯虾的规模化养殖,因此,了解低温对红螯光壳螯虾生长及生理的影响,进而找到提高其对低温耐受力的方法已成为该虾养殖产业可持续发展必须要解决的实际问题之一。目前有关低温对红螯光壳螯虾影响的研究很少,且主要集中在对其存活的影响,对低温下的生理生化反应和代谢调控影响的研究尚未见有报道。本研究综合了生物化学、分子生物学方法,结合转录组学技术,分别从个体水平、细胞水平和分子水平综合探究了低温胁迫下红螯光壳螯虾的生理反应及代谢调节状况,同时结合营养学手段,在红螯光壳螯虾进入越冬期之前对其进行了两种脂肪源不同配比下的营养强化,之后进行低温刺激,以期了解适合红螯光壳螯虾越冬的最适脂质营养需求。本文的主要研究结果和结论如下:1低温对红螯光壳螯虾存活、非特异性免疫及肝胰腺显微及亚显微结构的影响本研究设置了四个温度梯度,分别为25、20、15、9℃,养殖4周后分别检测其存活率、摄食率、肝体指数、抗氧化酶活性及细胞损伤修复相关基因小分子热休克蛋白21(HSP21)和冷休克蛋白(CSP)基因的影响,同时结合了对肝胰腺显微及亚显微结构的观察,探究低温对红螯光壳螯虾肝胰腺组织结构的影响。结果表明,随着温度的降低,红螯光壳螯虾的存活率、摄食率和肝体指数(HSI)都呈现了逐渐降低的趋势,其中温度最低的9℃组显著低于其他各组(P<0.05)。血淋巴中总抗氧化酶(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性均随着温度的降低呈逐渐降低趋势,而肝胰腺中T-AOC和SOD的变化趋势和血淋巴中相似,但GPx酶在低温组却出现了升高的趋势,而两种组织中的氧化损伤指标丙二醛(MDA)的含量均随着温度的降低而逐渐增多,表明低温下两种组织均受到了氧化损伤。随着温度的降低,HSP21和CSP基因的表达量呈现了先升高后降低的趋势,表明低温下红螯光壳螯虾启动了自身的防御机制,防止蛋白质错误折叠,但温度过低时,基因的表达量降低,其自身防护机能也有所下降。以上结果显示,慢性低温胁迫对红螯光壳螯虾的生长和免疫都产生了不利影响,但肝胰腺和血淋巴两种组织在低温条件下的免疫酶活性的变化并不完全相同,表明这两种组织在抵抗低温胁迫时可能表现出不同的生理功能。肝胰腺显微结果显示,在对照组和20℃组中,B细胞数量较多,15℃组中B细胞数量较少,而9℃组中几乎观察不到B细胞。超微结构观察显示,对照组中肝胰腺结构完整,微绒毛排列整齐,线粒体较多,内嵴清晰,各个细胞器结构均较完整。20℃组中肝胰腺结构也较为完整,线粒体内质网等结构完整、清晰,微绒毛排列整齐。15℃组中线粒体部分出现了肿胀变形,嵴出现断裂及空泡化现象。9℃组中细胞结构破坏较为严重,微绒毛排列杂乱,部分出现了脱落现象,线粒体嵴大面积断裂、边界模糊并出现了空泡化现象,内质网排列不整齐,出现了断裂现象,细胞中还观察到许多同心圆状结构、自噬泡及髓状体,细胞内质稀薄,出现了流失现象。肝胰腺凋亡染色结果显示,低温处理组肝胰腺凋亡率明显升高,为34.72%,显著高于对照组的3.11%,表明红螯光壳螯虾在低温下营养匮乏,且细胞结构受到了氧化损伤,引发了细胞凋亡。2去饱和酶基因的克隆及低温对其表达影响的研究去饱和酶在不饱和脂肪酸的合成过程中具有重要的作用。本文首次从红螯光壳螯虾肝胰腺组织中克隆获得完整的Δ6去饱和酶和Δ9去饱和酶cDNA全长序列。荧光定量PCR结果显示,Δ6去饱和和Δ9去饱和酶基因均在红螯光壳螯虾肝胰腺中表达量最高,显著高于其他各组织,而在不同温度条件下养殖一个月后的红螯光壳螯虾肝胰腺中,Δ6去饱和酶和Δ9去饱和酶基因的表达量随着养殖温度的降低而呈现了逐渐升高的趋势,说明低温刺激能够提高红螯光壳螯虾Δ6去饱和酶和Δ9去饱和酶的活性,这为深入研究Δ6去饱和酶基因在抵御低温胁迫过程中的作用提供了分子生物学的基础理论资料。Δ对Δ9去饱和酶蛋白进行定位发现,该蛋白在肝胰腺胞质中大量表达,且在9℃组中蛋白表达也出现了上调。3低温对红螯光壳螯虾肝胰腺转录组影响的研究分别从对照组(25℃)及最低温度组(9℃)中选取红螯光壳螯虾的肝胰腺组织进行转录组学测定和分析,测序后拼接共得到48035条序列,对所有序列进行数据库比对、注释分析后进行了差异表达分析,结果发现对照组和低温组中共有2,615条差异基因,其中1147条为上调表达,1468条为下调表达,KEGG和GO富集分析结果显示,差异基因主要参与物质和能量代谢、抗氧化防御、免疫防御及信号转导和凋亡调控等,且大部抗氧化及免疫基因在低温下呈现了负调控,而抗凋亡基因呈现了正调控趋势,表明低温下红螯光壳螯虾肝胰腺内非特异性免疫应答受到了抑制,而凋亡代谢比较活跃,表明这些代谢通路可能与红螯光壳螯虾低温调控有关。在差异基因中选取了15条能量代谢、抗氧化和免疫相关基因进行验证分析,结果显示荧光定量PCR结果与转录组测序结果高度一致,表明测序结果准确、可信,而转录组结果也为本文进一步研究低温下红螯光壳螯虾的低温调节机制提供了分子生物学的资料。4低温对红螯光壳螯虾脂质代谢影响的研究通过对不同温度下红螯光壳螯虾肝胰腺中总脂含量和血淋巴中甘油三酯、胆固醇和游离脂肪酸含量进行测定发现,随着温度的降低,肝胰腺中脂肪含量逐渐降低,在9℃组中与对照组相比差异显著,血淋巴中甘油三酯、胆固醇和自由脂肪酸水平也均呈现了不同程度的降低,表明低温下红螯光壳螯虾的能源物质储备降低,而脂质可能是作为低温压力下的重要能源物质。进一步对脂肪酶、脂肪酸合酶、乙酰辅酶A羧化酶及脂蛋白酯酶、去饱和酶6和去饱和酶9进行活性测定,结果发现脂肪酶、脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶及脂蛋白酯酶均随着温度的降低而呈下降趋势,但去饱和酶6和去饱和酶9活性变化趋势则与其他酶类相反,即随着温度的降低而逐渐升高。脂肪酸合成酶基因(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶基因(ACC)、肉碱棕榈酰转移酶基因(CPT-1)和鞘脂类去饱和酶4基因(DES-1)进行表达分析发现,除鞘脂类去饱和酶4基因外,其他基因的表达量均随着温度的降低而逐渐下降。以上研究结果表明,低温胁迫下肝胰腺中脂肪的消化、合成和分解均受到了抑制,但DES-1基因表达量升高,表明低温下去饱和通路代谢增强,推测低温下红螯光壳螯虾对高不饱和脂肪酸的需求升高。5饲料中不同n-3/n-6 PUFA比率对不同温度条件下红螯光壳螯虾的影响为探究不同n-3/n-6脂肪酸比率饲料对红螯光壳螯虾抵御低温压力的影响,以鱼油和豆油为脂肪源,配制脂肪源组成分别为:100%鱼油、鱼油与豆油比为2:1、鱼油与豆油比为1:2以及100%豆油4组饲料,其中n-3/n-6的比率分别为2.43,0.66,0.27和0.11。投喂四周后1℃/12h的速度进行降温实验,当温度分别达到25±1℃、20±1℃、15±1℃和9±2℃后继续进行为期4周的低温处理,结束后分别统计各组存活率、肝体指数和血细胞数,并检测了其抗氧化酶活性和氧化损伤情况、免疫相关酶活性及机体健康状况的评价指标谷草及谷丙转氨酶活性,结果显示,红螯光壳螯虾的存活率均随着温度的降低而呈下降趋势,且存活率变化主要与温度改变有关,与饲料中脂质的变化关系不明显。肝体指数各组间差异不显著。血细胞数同时受温度变化和脂肪酸含量变化的影响,其中,15℃,100%鱼油添加组中血细胞数显著高于其余添加组。抗氧化酶活性测定结果显示,100%鱼油添加组中抗氧化酶活性总体高于其他三个添加组,而氧化损伤各组间差异不显著。免疫酶活性测定结果显示,混合鱼油组中碱性磷酸酶活性在100%鱼油组和混合鱼油组中出现了显著升高,普遍高于豆油组。谷丙转氨酶(GPT)酶活性发现,在25℃组中,各组间GPT活性无显著差异,在20℃组和15℃组中,GPT酶活性在100%鱼油组中最低,而当温度降到9℃组时,两个混合油组中GPT酶活性最低,显著高于鱼油组和豆油组。表明在低温条件下,混合鱼油对红螯光壳螯虾有更好的保护作用。