论文部分内容阅读
第一章:LncRNA SNHG12在ALI小鼠体内和LPS诱导的PMVEC细胞中的表达及功能目的:急性肺损伤（Acute Lung Injury,ALI）是一种在世界范围内广泛分布的疾病,其病因多种多样,发病机制非常复杂。因此,深入了解ALI的发生、发展和调控机制至关重要。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）在不同水平调控基因表达。近年来,有发现LncRNA SNHG12参与ALI的发生和进展。然而,SNHG12在ALI中的确切作用仍然很大程度上未知。因此,通过阐明SNHG12对ALI发生和进展的影响,将为理解ALI疾病的发生发展,以及进一步发现新的治疗手段来提供理论的基础依据。本章节旨在研究:1.体内水平探究LncRNA SNHG12在LPS诱导的ALI小鼠模型肺组织以及血液中的表达;2.细胞水平探究LncRNA SNHG12对LPS诱导ALI细胞模型的凋亡、炎性因子水平以及细胞活性氧（ROS）含量和通透性的影响。方法:利用LPS诱导建立ALI小鼠模型,收集小鼠组织、血液以及支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid,BALF）,利用逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）检测ALI 小鼠组织及血液中SNHG12的表达。利用ELISA检测BALF中的炎性因子:肿瘤坏死因-α（Tumor Necrosis Factor α,TNF-α）、白细胞介素-1β（Interleukin 1β,IL-1β）、白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）水平。此外,进行大鼠肺微血管内皮细胞（Pulmonary Microvascular Endothelial Cells,PMVEC）培养,之后进行细胞转染并分组:Control 组,脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导组,LPS+Vector组以及LPS+SNHG12组,利用RT-PCR检测SNHG12在PMVEC细胞中的转染效率,以及检测各转染组SNHG12的表达水平;利用流式细胞术检测SNHG12过表达后LPS诱导肺血管内皮细胞损伤模型的凋亡情况;利用ELISA检测SNHG12过表达后LPS诱导肺血管内皮细胞损伤模型中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平;以及利用ROS检测试剂盒及细胞通透性实验检测SNHG12过表达后对LPS诱导肺血管内皮细胞损伤模型中ROS含量和细胞通透性的影响。结果:1.RT-PCR实验结果显示:与Normal组相比,ALI组肺组织以及血液中SNHG12的表达水平呈现低表达。此外,ALI模型BALF中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著高于Normal组。细胞实验结果显示,转染SNHG12过表达质粒后,PMVEC细胞中的SNHG12水平显著增加;2.细胞实验显示:与Control组相比,LPS诱导组和LPS+vector组细胞中SNHG12的表达水平显著降低,LPS+SNHG12组细胞中SNHG12的表达水平显著高于LPS+vector组,表明SNHG12可以稳定转染PMVEC细胞和肺血管内皮细胞损伤模型,有利于后续实验的展开;此外,细胞功能实验结果显示,与Control组相比,LPS诱导组和LPS+vector组细胞中细胞的凋亡、炎性因子水平以及ROS水平和细胞的通透性被显著上调,LPS+SNHG12组细胞中细胞的凋亡、炎性因子水平、ROS水平和细胞的通透性显著低于LPS+vector组,结果提示SNHG12过表达后可以显著抑制LPS对肺血管内皮细胞损伤模型的影响。结论:1.LncRNA SNHG12在ALI模型小鼠肺组织和血液中低表达;2.在LPS诱导的ALI细胞模型中,LncRNA SNHG12过表达抑制细胞凋亡、炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平、以及抑制细胞的ROS水平和细胞通透性。第二章:LncRNA SNHG12调控基因及其下游靶基因的预测与鉴定目的:前文探讨了 LncRNA SNHG12在小鼠ALI模型体内和LPS诱导的肺血管内皮细胞损伤模型中的表达及功能,得出了下面的结果:LncRNA SNHG12在ALI模型小鼠肺组织和血液中低表达;同时在LPS诱导的ALI细胞模型中,LncRNA SNHG12过表达抑制细胞凋亡、炎性因子水平、以及抑制细胞的ROS水平和细胞通透性。但是与SNHG12相关的miRNA及后续的mRNA,对调控炎性因子的表达、细胞凋亡水平、ROS和细胞通透性的影响少有报道。因此本章节旨在探讨:1.探究LncRNA SNHG12调控的miRNA,及其下游靶基因;2.探究LncRNA SNHG12是否通过靶向miR-140-3p调节LPS诱导的肺血管内皮细胞损伤模型的凋亡、炎性因子水平以及细胞中ROS水平和细胞通透性;3.探究miR-140-3p是否通过靶向FNDC5调节LPS诱导肺血管内皮细胞损伤模型的凋亡、炎性因子水平以及细胞中ROS水平和细胞通透性;方法:1.通过在线预测与LncRNA SNHG12存在调控作用的miRNA（miR-140-3p）,及在线预测miR-140-3p的下游靶基因FNDC5,并分别利用双荧光素酶报告进行靶向关系的验证;2.进行细胞转染并分组:Control组、LPS诱导组、LPS+Vector组以及LPS+SNHG12组,利用RT-PCR实验检测SNHG12对miR-140-3p表达的影响;再次进行细胞转染并分组:LPS 诱导组,LPS+si-SNHG12 组、LPS+si-SNHG12+inhibitor NC 组、LPS+si-SNHG12+miR-140-3p inhibitor 组,分别利用流式细胞术、ELISA实验以及利用ROS检测试剂盒和细胞通透性实验检测各实验组细胞凋亡水平、炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及各实验组细胞中ROS含量和细胞的通透性。其次,利用RT-PCR实验检测miR-140-3p过表达对FNDC5表达的影响;3.通过细胞转染并分组:LPS诱导组、LPS+miR-140-3p组、LPS+miR-140-3p+vector组、LPS+miR-140-3p+FNDC5组,并分别利用流式细胞术、ELISA实验以及利用ROS检测试剂盒和细胞通透性实验检测各实验组细胞凋亡水平、炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及各实验组肺血管内皮细胞中ROS含量和细胞的通透性。结果:1.在线预测和双荧光素酶结果显示,与LncRNA SNHG12存在调控作用的miRNA 为 miR-140-3p,miR-140-3p 的下游靶基因为 FNDC5;2.SNHG12过表达在LPS诱导的肺血管内皮细胞损伤模型中可以显著抑制miR-140-3p的表达水平;miR-140-3p过表达可以显著抑制FNDC5的表达;LPS诱导组可以显著上调PMVEC细胞的凋亡水平、炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平、ROS含量以及细胞的通透性。同时,经过共转染si-SNHG12后可以进一步上调PMVEC细胞的凋亡、炎性因子水平、ROS含量以及细胞通透性,而LPS+si-SNHG12+miR-140-3p inhibitor 组的细胞凋亡水平与 LPS+si-SNHG12+inhibitor NC组相比,细胞的凋亡水平、炎性因子水平、ROS含量以及细胞通透性被显著下调,表明PMVEC细胞被LPS诱导损伤后,当细胞中再次经过SNHG12沉默处理后会导致细胞损伤的加重,当共转染miR-140-3p inhibitor后可以部分改善细胞损伤的情况;3.LPS诱导组可以显著上调细胞的凋亡水平、炎性因子水平、ROS含量以及细胞通透性。经过共转染miR-140-3p及miR-140-3p+vector后可以进一步上调细胞的凋亡水平、炎性因子水平、ROS含量、细胞通透性。而LPS+miR-140-3p+FNDC5组与LPS+miR-140-3p+vector组相比,细胞的凋亡水平、炎性因子水平、ROS含量以及细胞通透性被显著下调,表明PMVEC细胞被LPS诱导损伤后,当细胞中再次经过miR-140-3p过表达处理后会导致细胞损伤的加重,当共转染FNDC5后可以逆转miR-140-3p对细胞损伤的促进作用。结论:1.SNHG12和miR-140-3p存在靶向调节作用,SNHG12在LPS诱导的肺血管内皮细胞损伤模型中可以显著抑制miR-140-3p的表达水平;2.SNHG12通过靶向miR-140-3p抑制LPS诱导的肺血管内皮细胞损伤模型的细胞凋亡、炎性因子水平、细胞中ROS水平和细胞通透性;3.miR-140-3p的下游靶基因为FNDC5,在PMVEC细胞中miR-140-3p过表达抑制FNDC5的mRNA水平;4.miR-140-3p通过靶向FNDC5调节LPS诱导肺血管内皮细胞损伤模型的细胞凋亡、炎性因子水平、细胞中ROS水平和细胞通透性。第三章:LncRNA SNHG12 通过靶向调节 m i R-140-3p/FNDC5保护ALI小鼠肺血管内皮损伤目的:前两章主要探讨了 LncRNA SNHG12通过靶向调节miR-140-3p/FNDC5对LPS诱导的肺血管内皮细胞损伤模型的保护。本章节主要探究LncRNA SNHG12是否通过靶向调节miR-140-3p/FNDC5保护ALI小鼠肺血管内皮细胞的损伤。方法:利用LPS诱导BALB/c小鼠建立ALI模型并分组:Sham组、LPS诱导组、LPS+Vector组和LPS+SNHG12组,收集各实验组小鼠组织和BALF,利用RT-PCR检测各实验组小鼠组织中SNHG12、miR-140-3p以及FNDC5的表达水平,随后利用HE染色观察SNHG12对各组小鼠肺组织病理学的影响;TUNEL染色试验观察SNHG12对各组小鼠肺组织细胞凋亡的影响;ELISA检测各组小鼠BALF中炎性因子的水平;Western Blot检测各组小鼠肺组织中细胞因子CD31的表达。结果:1.RT-PCR实验结果显示,与Sham组相比,LPS诱导组和LPS+Vector组组织中SNHG12和FNDC5表达水平被显著抑制,miR-140-3p的表达水平被显著升高,与LPS+Vector组相比,LPS+SNHG12组组织中SNHG12和FNDC5表达水平被显著上调,miR-140-3p的表达水平被显著抑制。表明在体内水平,SNHG12干预LPS诱导小鼠ALI模型后,小鼠肺组织中SNHG12和FNDC5的表达被显著升高,而对miR-140-3p的表达存在抑制作用;2.对各组小鼠肺组织进行HE染色发现,Sham组小鼠肺组织结构完整,并且未有组织液渗出,而LPS诱导组和LPS+Vector组小鼠的肺组织明显的出现了肺泡的扩张,在血管壁上出现了中性粒细胞的粘附,肺组织的充血和组织液的渗出,同时可以观察到肺泡结构不完整。而当经过SNHG12干预处理后,与LPS+Vector组相比,LPS+SNHG12组小鼠肺组织病变程度有所改善,并减少了病变分布。TUNEL染色实验结果发现LPS诱导的小鼠ALI模型经过SNHG12干预后,肺组织细胞凋亡程度有所改善;3.通过检测各组小鼠BALF中炎性因子水平发现,SNHG12干预可以显著抑制炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平;4.经过SNHG12干预的ALI小鼠肺组织中CD31的表达被显著上调。结论:1.在LPS诱导的小鼠ALI模型中,SNHG12过表达可以显著抑制miR-140-3p的表达,促进FNDC5的表达;2.在LPS诱导的小鼠ALI模型中,SNHG12过表达可以改善小鼠肺组织病变程度以及减少病变分布;3.在LPS诱导的小鼠ALI模型中,SNHG12过表达可以降低肺损伤细胞的凋亡率;4.在LPS诱导的小鼠ALI模型中,SNHG12过表达可以抑制LPS诱导小鼠ALI模型BALF中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平;5.在LPS诱导的小鼠ALI模型中,SNHG12过表达可以增强组织中CD31的表达。