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神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)以四聚体形式嵌在流感病毒表面,是重要的功能蛋白,可切割唾液酸(Sialic acid, SA)促进子代病毒的释放,是抗流感病毒药物的重要靶点。现有以NA为靶点的药物均是SA类似物,通过竞争结合病毒表面NA而抑制其活性,进而阻断子代病毒的释放。甲型H7N9流感病毒[A/Hangzhou/1/2013 (H7N9),简称H7N9]是首个确认的可感染人的H7N9毒株,于2013被分离发现,本研究以其神经氨酸酶为研究对象,建立了野生NA酶水平药物评价模型,并比较了扎那米韦和奥司他韦对此株病毒与H1N1、H3N2和H5N1的药效学。流感病毒耐药是治疗病毒性流感的难点,确认药物对突变病毒的敏感性有助于临床用药。达菲是抗流感病毒的储备药,临床出现的达菲耐药病毒最常见突变位点是H274Y和R292K(根据N2亚型序列确定编号)。据此,本研究建立了NAH7N9-H271Y和NAH7N9-R289K酶活性评价模型,并应用模型检测了扎那米韦和奥司他韦药效学。此外,在实验室前期工作基础上,本研究重复了以流感病毒[A/California/04/2009(H1N1),简称CA/04]和[A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1),简称PR/8]神经氨酸酶为靶点的野生酶水平药物评价模型,并在获得流感病毒[A/Wyoming/03/2003(H3N2),简称WY/N2]、[A/WSN/1933(H1N1),简称WS/33]和[A/Viet Nam/1203/2004(H5N1),简称VN/04]神经氨酸酶质粒的基础上,完善了这些毒株的野生NA酶水平药物评价模型。模型经阳性药验证,结果显示扎那米韦对神经氨酸酶的半数抑制浓度(The half maximal inhibitory concentration, IC50)分别为NAH7N9-WT:1.1±0.1 nmol·L-1; NAH7N9-H271Y:1.4±0.2 nmol·L-1; NAH7N9-R289K:38.0±5.9 nmol·L-1; NACA/04-WT:0.3±0.1 nmol·L-1; NApr/8-WT:0.3±0.1 nmol·L-1; NAWY/N2-WT:1.1 ±0.4 nmol·L-1; NAWS/33-WT: 0.4±0.1 nmol·L-1; NAVN/04-WT:0.8±0.1 nmol·L-1;奥司他韦羧酸盐对神经氨酸酶的IC50分别为NAH7N9-WT:1.6 ±0.6 nmol·L-1; NAH7N9-H271Y:15.1±2.6 nmol·L-1;大于1000.0 nm0l·L-1。结果表明：(1)扎那米韦对NAH7N9-wr的抑制活性与其他毒株相当,提示该药物能有效抑制野生H7N9流感病毒,可用于治疗携带该病毒的病人；(2)NAH7N9-R289K病毒对扎那米韦和奥司他韦均耐药,耐药倍数分别为34倍和大于625倍,提示当病人感染该突变病毒时建议停止使用这2种药物；(3)NAH7N9-H271Y病毒对扎那米韦和奥司他韦均不耐药,提示临床出现该突变毒株的可能性较小。唾液酸类似物结构特征的神经氨酸酶抑制剂(Neuraminidase Inhibitor, NAI)是临床一线抗流感病毒药物,其缺点是容易产生耐药病毒和引起较严重神经精神异常副作用(Neuropsychiatric Adverse Events,NPAEs).流感病毒为RNA病毒,基因在复制过程中易发生突变,在药物存在下,产生耐药突变的病毒可存活并繁殖。由于现有NAI均是唾液酸类似物,导致NA耐药突变位点相似,临床表现为交叉耐药及多药耐药性。NA在生物中广泛存在,人体内不同组织和器官中也存在着组成性的神经氨酸酶家族。扎那米韦和奥司他韦等作为SA类似物也可与人体组成性NA结合并抑制其活性,影响其正常生理功能,产生药物副作用,临床表现为幻觉、行为异常、惊厥和精神错乱等,降低患者生活质量。因此,出于减少耐药和避免NPAEs双重考虑,寻找非底物类似物的神经氨酸酶抑制剂具有重要意义。本研究以成药库为基础寻找新型非SA类似物的神经氨酸酶抑制剂。首先应用野生高致病流感毒株[A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)]NA酶学模型评价了1600个上市药物,获得药物终浓度为104 mol·L-1,抑制率≥160%的活性化合物40个。然后综合这些药物原适应症、作用靶点、机制、副作用以及血药浓度等信息,从中挑出12个药物,评价了它们对NAPR/8-WT的影响,最终得到4个较优药物：利福平、盐酸非那吡啶、柳氮磺胺吡啶和原卟啉Ⅸ。结果显示它们对NAH7N9-WT的ICso分别为大于100 μmol·L-1(利福平)、90.6μmol·L-1(盐酸非那吡啶)、77.6μmol·L-1(柳氮磺胺吡啶)和38.6μmol·L-1(原卟啉Ⅸ)；对NAH7N9-H271 Y的ICso分别为大于100μmol·L-1(利福平)、大于100 μm0l·L-1(盐酸非那吡啶)、88.5μmol·L-1(柳氮磺胺吡啶)和大于100μmol·L-1(原卟啉Ⅸ)；对NAH7N9-R289K的ICs0分别为99.8 μmol·L-1(利福平)、91.4 μmol·L-1(盐酸非那吡啶)、57.8μmol·L-1(柳氮磺胺吡啶)和61.0μmol·L-1(原卟啉Ⅸ)；对NACA/04-WT的ICso分别为大于100 μm0l·L-1(利福平)94.3 μmol.L-1(盐酸非那吡啶)、97.5 μmol·L-1(柳氮磺胺吡啶)和54.5μmol·L-1(原卟啉Ⅸ)；对NAPR/8-WT的IC5o分别为大于100μmol·L-1(利福平)、大于100 μmol-1(盐酸非那吡啶)、90.8 μmol.L-1(柳氮磺胺吡啶)和43.0μmol·L-1(原卟啉Ⅸ)；对NAWY/N2-WT的ICso分别为大于100 μmol·L-1(利福平)、69.7 μmol·L-1(盐酸非那吡啶)、85.6 μmol·L-1(柳氮磺胺吡啶)和69.9 μmol·L-1(原卟啉Ⅸ)；对NAWS/33-WT的IC5o分别为98.7 μmol·L-1(利福平)、94.4μmol·L-1(盐酸非那吡啶)、75.6 μmol·L-1(柳氮磺胺吡啶)和51.2 μmol·L-1(原卟啉Ⅸ)；对NAVN/04-WT的IC50分别为大于100μmol·L1(利福平)、90.8 pmol·L-1(盐酸非那吡啶)、86.8 μmol·L-1(柳氮磺胺吡啶)和54.8 μmol·L-1(原卟啉Ⅸ)。本论文还评价了天然产物单体、化学合成或生物合成来源的小分子化合物236个,结果发现了1个活性化合物(WB813),其对神经氨酸酶的半数抑制浓度分别为：NAcA/04-WT:15.6 μmol·L-1;NAPR/8-WT:58.0 μmol·L-1;NAWY/N2-WT:6.3μmol·L-1; NAWS/33-WT:66.9 μmol·L-1;NAVN/04-WT:13.2 μmol·L-1,对NAH7N9-WT、NAH7N9-H271Y和NAH7N9-R289K抑制活性较低,IC50均大于100 μmol·L-1。综上所述,本论文首先构建了2013年人感染H7N9流感毒株野生NA酶水平药物评价模型,然后预测并建立了两种奥司他韦耐药型突变NA酶活性评价模型,研究结果可为临床治疗携带野生或突变H7N9病毒的病人提供参考。本研究还重复和完善了以其他株甲型流感病毒NA为靶点的酶水平药物评价模型,应用模型对包含1600个上市药物的成药库和236个小分子化合物进行筛选,最后得到了5个活性化合物,值得注意的是其中4个化合物都不是SA类似物,为新型NAI的设计和寻找提供思路。