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马铃薯(Solaum tuberosum L)是世界第四大粮食作物,在保障粮食安全和促进经济发展方面起重要作用。随着人们生活水平的提高,马铃薯加工产品消费不断增加,其中油炸加工食品占主要地位。为了避免块茎发芽、皱缩失水及病害传播等造成的损失,原料马铃薯块茎通常进行低温储藏。但是,块茎低温储藏(<10℃)期间细胞内淀粉会大量的向还原糖转化,出现“低温糖化”现象。油炸过程中还原糖与自由氨基酸发生Maillard反应,导致产品变色,同时生成丙烯酰胺,严重影响产品品质。前期对马铃薯块茎低温糖化的机理研究主要集中在淀粉ˉ糖代谢过程中关键酶的功能上,但是尚不清楚对低温糖化产生影响的主要途径,也不明确相关代谢途径中酶活性的调节方式。本实验室从抗低温糖化野生种S. berthaultii块茎中分离得到188条低温条件下的差异表达基因,且根据基因表达谱初步推断淀粉降解、蔗糖分解以及糖酵解途径在低温糖化过程中可能起到关键作用。在此基础上,本研究利用对低温糖化具有不同抗性的马铃薯基因型进行部分ESTs表达谱分析,筛选在抗性基因型低温处理块茎中高表达的ESTs。通过克隆和基因功能互补研究,明确其在低温糖化过程中的作用及其机理,以加深对马铃薯低温糖化调控机制的认识。取得的主要结果如下：1.马铃薯低温糖化相关基因表达分析利用3个低温糖化抗性基因型和3个低温糖化敏感基因型块茎分别于4℃和20℃储藏0d, 5d,15d,30d,45d,60 d的cDNA,对初步筛选出的43条ESTs进行表达谱分析。结果显示,4条已知功能ESTs C20-3-A14、C20-1-G06、C4-1-I07及C20-2-N12和4条未知功能ESTs C20-3-E15、C20-5-M08、C20-1-F10、C20-2-B24只在抗性基因型中表达。特别是ESTs C20-3-E15和C20-5-M08,只在4℃处理的抗性基因型块茎中高表达,推测其与马铃薯低温糖化有关,用于进一步研究。2.C20-3-E15和C20-5-M08全长克隆与结构分析根据EST C20-3-E15和C20-5-M08序列结合马铃薯基因组数据库信息,利用RACE方法从S. berthaultii块茎cDNA中分别克隆得到两个ESTs的全长cDNA序列。C20-3-E15 cDNA全长799bp,含621bp编码区,编码207个氨基酸；扩增gDNA序列得到1788bp,包含4个外显子和3个内含子；启动子序列含有糖代谢、淀粉酶、冷胁迫和糖酵解等低温糖化相关元件。推导的氨基酸序列中具有Tryp_alpha_amyI结构域,与淀粉酶抑制子类似,因此将该基因命名为SbAI。 C20-5-M08 cDNA全长796bp,包括504bp编码168个氨基酸的开放阅读框、39bp的5’非翻译区和253bp的3’非翻译区；该基因gDNA序列含有2个外显子和1个内含子；启动子序列含有淀粉、冷胁迫、无氧呼吸和代谢等低温糖化相关元件。推导的氨基酸序列含有1个IBR (In Between Rings)结构域和1个RING (Really Interesting Gene) finger结构域,与RING finger protein类似,故将基因命名为SbRFPl。3.马铃薯淀粉酶抑制子基因SbAI功能研究根据马铃薯基因组数据库和NCBI (nr/nt)数据库淀粉降解相关的α-淀粉酶基因、β-淀粉酶基因、异淀粉酶基因和淀粉磷酸化酶等基因的序列设计引物,研究这些基因在抗低温糖化基因型AC030-06和低温糖化敏感基因型E3不同组织中的表达模式,为研究SbAI和SbRFPl的功能提供基础。结果表明,α-淀粉酶的功能主要由Amy23基因控制,β-淀粉酶的功能主要由BAM1和BAM9基因控制。结合不同储藏时期的块茎中淀粉酶活性和还原糖含量变化发现,Amy23、BAM1和BAM9在马铃薯块茎低温糖化和块茎发芽过程中均具有作用。构建SbAI超量表达载体和干涉载体,分别转化马铃薯E3和AC142-01试管薯。测定转基因株系低温储藏块茎中糖化相关指标,与对照相比,超量转基因株系块茎低温储藏后炸片色泽变浅,还原糖含量、淀粉酶活性、淀粉降解率降低,而干涉转基因株系块茎则相反。结果说明,SbAI在马铃薯块茎中通过降低淀粉酶活性减缓淀粉降解速率,从而达到控制还原糖的积累。同时,双分子荧光互补实验证明,SbAI蛋白与α-淀粉酶Amy23及β-淀粉酶BAM1和BAM9在植物细胞内互作。原核表达SbAI蛋白的活性抑制实验证明,SbAI对马铃薯块茎中α-淀粉酶活性和β-淀粉酶活性均有抑制作用,且抑制程度相似。体内体外实验结果表明,马铃薯淀粉酶抑制子SbAI通过与淀粉酶互作抑制了淀粉酶活性,降低了块茎中淀粉降解速率,从而调控了马铃薯块茎的低温糖化。4.马铃薯RING finger基因SbRFP1功能研究本研究构建了SbRFP1基因的超量和干涉表达载体,分别转化马铃薯E3和AC142-01试管薯。超量表达载体转基因株系块茎低温储藏以后与对照相比,炸片色泽变浅,还原糖含量显著降低,而干涉转基因株系块茎则相反,证明SbRFP1基因对改良低温糖化起重要作用。为了揭示SbRFP1基因的作用机理,本研究观察了淀粉ˉ糖代谢途径中关键酶基因在4℃储藏30 d的转基因株系块茎中的转录水平。结果显示,仪-淀粉酶基因 Amy23、β-淀粉酶基因BAMl和转化酶基因StvacINV1的表达量受SbRFP1基因表达量的影响。同时,超量转基因块茎与对照相比,pˉ淀粉酶活性和转化酶活性降低,淀粉降解速率降低,而干涉转基因块茎则相反。转化酶活性与还原糖、蔗糖比值成正相关。本研究结果证明,SbRFP1基因调节了β-淀粉酶活性和转化酶活性,影响了淀粉降解和蔗糖向还原糖的转化,最终控制还原糖积累。本研究中的2个基因均是通过对淀粉酶活性的调节发挥作用,是控制马铃薯低温糖化的新的调节基因。为马铃薯块茎低温糖化机制的研究提供了理论基础和基因资源。