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目的:1.评估丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)预处理抗大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用和量效关系;2.评估Sal B预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤中炎症反应、细胞凋亡的影响;3.探讨Sal B在大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌保护中对心肌SIRT1表达,及由SIRT1介导的相关蛋白表达的影响;4.在心肌细胞糖氧剥夺再灌(oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGDR)模型下,探讨Sal B心肌保护作用与SIRT1蛋白表达、炎症反应、细胞凋亡间的关系。方法:A.动物实验部分:本研究采用SD大鼠心肌缺血再灌注模型,SD大鼠随机入组,组别分别为:SHAM组,缺血再灌注模型(Ischemia/Reperfusion,I/R)组,Sal B LD 组(LD:30mg/kg),SalB HD 组(HD:60mg/kg),SalB HD+EX527 组(EX527:2mg/kg);每组 N=16。给药4天后,除SHAM组行假手术外,其余各组均结扎冠脉左前降支(left anterior descdending coronary,LAD)0.5h,复灌24h,后进行下一步骤:1.所有大鼠行心脏超声,检测大鼠心功能;2.后腹主动脉取血,离心后取上清-20℃冻存,以备Elisa用;3.取心脏组织,随机从各组中取3只大鼠心脏多聚甲醛固定,制作石蜡切片,以备 TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)/IHC(immunohistochemistry)用;另各组中随机取3只大鼠行TTC染色;剩余大鼠心脏取出后剪取梗死边缘区2mm心脏组织提取蛋白,以备western blot用;具体观察指标如下:1.心脏功能和大小:心脏超声①左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)、每搏输出量(stroke volume,SV)左室收缩末内径(left ventricular end systolic diameter,LVESD)、左室舒张末内径(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)等;2.心肌损伤标志物及炎症指标:Elisa法测LDH/CK-MB/TNF-α/IL-1β/IL-18/HMGB1;3.心脏梗死面积检测:TTC染色;4.心肌梗死缺血再灌注心脏组织凋亡观察:TUNEL染色;5.组织蛋白免疫组化检测:SIRT1/ac-HMGBl/TLR4;6.心肌梗死缺血再灌注损伤信号通路作用靶点检测:western blot:SIRT1、ac-HMGB1、c-HMGB1、N-HMGB1、TLR4、NF-κ B、Bcl-2、Bax;B.细胞实验部分:采用H9C2细胞,探索建立细胞OGDR细胞模型条件、SIRT1抑制剂EX527最小有效浓度以及SalB细胞毒性测定,确定SalB干预浓度;分组如下:Control组,Sal B组,Model 组,Sal B LD 组,Sal B HD 组,SalB HD+EX527 组;实验步骤如下:第一阶段,将密度为2*104个/ml的心肌细胞均匀种于96孔板中孵育24h。OGDR组分别用无糖培养基在低氧(1%O2)环境下培养,后更换正常培养基,常规培养箱培养,探索OGDR模型建立条件;6孔板孵育H9C2,control组不做任何处理,EX527组分别用50 μM,25μM,12.5 μM三个浓度,westernblot测定SIRT1表达水平,确定EX527最小有效浓度;SalB组毒性试验:MTT法,分别用200 μM,100μ M,50μ M,0μ M测定Sal B最高安全浓度;第二阶段,分别对 control 组,SalB 组,Model 组,Sal B LD 组,Sal B HD 组,SalB HD+EX527组予药物处理,培养24h后,建立OGDR模型,之后检测下列指标:1.MTT检测:在OGDR模型下,不同浓度SalB预处理后H9C2细胞的活性;2.细胞损伤标志物及炎症指标检测:Elisa法检测培养基LDH/CK-MB/TNF-α/HMGB1;3.细胞内损伤信号通路相关蛋白检测:western blot检测SIRT1、ac-HMGB1、TLR4、NF-κ B;Bcl-2,Bax。结果:A.动物实验:1.心脏功能评价:I/R 组大鼠 EF、FS、SV 低于正常组(P<0.05);Sal B LD 组、Sal B HD 组 EF 与I/R 组比较,EF 均高于 I/R 组(P<0.05);Sal B HD 组 EF 高于 Sal B LD 组(P<0.05);Sal B HD+EX527 组 EF、FS、SV 低于 Sal B HD 组(P<0.05)。I/R 组心率高于正常组,Sal B LD 组、Sal B HD 组、Sal B HD+EX527 组与 I/R 无差异(P>0.05)。2.心肌损伤标志物评价I/R组大鼠心肌LDH、CK-MB水平高于正常组(P<0.05);Sal B LD组、Sal B HD组与I/R组比较,LDH、CK-MB水平均低于I/R组(P<0.05);Sal B HD组LDH、CK-MB水平低于 Sal B LD 组P<0.05);与 Sal B HD 组相比,Sal B HD+EX527 组 LDH、CK-MB水平上升(P<0.05)。3.解剖学评价:I/R组大鼠心肌梗死面积显著高于正常组(P<0.05);Sal B LD组、Sal B HD组与I/R组比较,梗死面积占左室面积的百分比均低于I/R组(P<0.05);Sal B HD组心肌梗死面积低于Sal B LD组(P<0.05);与Sal B HD组相比,Sal B HD+EX527组梗死面积升高(P<0.05);4.病理学评价:Tunel染色:I/R组大鼠细胞凋亡率高于正常组(P<0.05);Sal B LD组、Sal B HD组与I/R组比较,细胞凋亡率均低于I/R组(P<0.05);Sal B HD组细胞凋亡率低于Sal B LD 组(P<0.05);与 Sal B HD 组相比,Sal B HD+EX527 组率升高(P<0.05)。5.组织蛋白表达评价:Western blot:I/R 组大鼠心肌 SIRT1、Bcl-2、N-HMGB1 表达低于正常组(P<0.05);Sal B LD组、Sal B HD组与I/R组比较,心肌SIRT1、Bcl-2、N-HMGB1表达均高于I/R 组(P<0.05);Sal B HD 组 SIRT1 Bcl-2、N-HMGB1 表达高于 Sal B LD 组(P<0.05);与 Sal B HD 组相比,Sal B HD+EX527 组 SIRT1、Bcl-2、N-HMGB1 表达降低(P<0.05)。与之相反的是,I/R组SD大鼠心肌C-HMGB1、ac-HMGB1、Bax、TLR4、NF-κ B表达高于正常组(K0.05);Sal B LD 组、Sal B HD 组与 I/R 组比较,C-HMGB1、ac-HMGB1、Bax、TLR4、NF-κ B 表达均低于 I/R 组(P<0.05);Sal B HD 组 C-HMGB1、ac-HMGB1、TLR4、NF-κ B、Bax 表达低于 Sal B LD 组(K0.05);与 Sal B HD 组相比,Sal B HD+EX527组C-HMGB1、ac-HMGBl、TLR4、NF-κ B、Bax 表达升高(P<0.05)。免疫组化:I/R组大鼠心肌SIRT1表达低于正常组(P<0.05);Sal B LD组、Sal B HD组与I/R组比较,SIRT1均高于I/R组(P<0.05);Sal B HD组SIRT1表达高于Sal B LD 组(P<0.05);与 Sal B HD 组相比,Sal B HD+EX527 组 SIRT1 降低(P<0.05)。与之相反的是,I/R组SD大鼠ac-HMGB1、TLR4表达高于正常组(P<0.05);Sal B LD组、Sal B HD组与I/R组比较,ac-HMGB1、TLR4表达均低于I/R组(P<0.05);Sal B HD组ac-HMGB1、TLR4表达低于Sal B LD组,有显著性差异(P<0.05);与Sal B HD组相比,Sal B HD+EX527 组 ac-HMGB1、TLR4 表达升高(P<0.05)。6.炎症相关因子评价I/R 组大鼠 TNF-α、HMGB1 水平高于正常组(P<0.05);Sal B LD 组、Sal B HD组与I/R组比较TNF-α、HMGB1水平均低于I/R组(P<0.05);Sal B HD组TNF-α、HMGB1 水平低于 Sal B LD 组(P<0.05);与 Sal B HD 组相比,Sal B HD+EX527 组 LDH、CK-MB水平显上升(P<0.05)。B.细胞实验:1.OGDR细胞模型的建立:在缺氧24h,复氧2h时细胞活率到达63.8%,复氧4h细胞活性上升至80.1%。据此,确定OGDR模型建立时间为:缺氧24h,复氧2h。2.Sal B对H9C2心肌细胞的毒性评估:结果显示100 μ M、200 μ M细胞活性下降至76.7%和47.1%;50μM则与0μM无统计学差异(P>0.05)。因此,确定Sal B最高给药浓度为50 μM(设为细胞模型中:Sal B HD组),另设置25 μM为低剂量组(Sal B LD组);3.在OGDR模型下,Sal B预处理对细胞活性的评价:在OGDR条件下,Sal B 25μ M、50μM分别提高细胞活性至75.2%和86.6%,且Sal B 25 μM与Sal B 50 μM间细胞活性比较,差异有统计学意义(P<0.05),改善细胞活性呈浓度依赖性;EX527逆转了 Sal B的这种作用。4.蛋白表达评价:Model 组 SIRT1 表达低于 control 组(P<0.05);与 Model 组比较,Sal B LD 组、Sal B HD 组 SIRT1、Bcl-2 表达均升高(P<0.05),而 ac-HMGB1、TLR4、NF-κB、Bax表达下降(P<0.05);Sal B HD组SIRT1、Bcl-2表达高于Sal B LD组(P<0.05),ac-HMGB1、TLR4、NF-κ B、Bax低于Sal BLD组(P<0.05);与Sal B HD组相比,Sal B HD+EX527组 SIRT1、Bcl-2 表达降低(P<0.05),同时 ac-HMGB1、TLR4、NF-κ B、Bax 增高(P<0.05)。5.炎症相关因子评价I/R 组 TNF-α、HMGB1 水平高于正常组(P<0.05);Sal B LD 组、Sal B HD 组与I/R 组比较 TNF-α、HMGB1 水平均低于 I/R 组(P<0.05);Sal B HD 组 TNF-α、HMGB1水平低于 Sal B LD 组(P<0.05);与 Sal B HD 组相比,Sal B HD+EX527 组 TNF-α、HMGB1水平上升(P<0.05)。结论:1.Sal B能够有效改善心肌缺血再灌注损伤,呈剂量依赖性;2.Sal B减轻心肌缺血再灌注损伤的机制可能是通过上调心肌SIRT1的表达从而抑制了 HMGB1的核移位与分泌,通过SIRT1介导的HMGB1/TLR4/NF-κ B信号通路,与改善大鼠心肌炎症水平、细胞凋亡有关;3.Sal B减轻了心肌细胞的炎症水平,起到了“凉血消痈”的作用,我们因此推断“热毒”可能是心肌缺血再灌注损伤的中医症候本质之一;SIRT1可能是丹参凉血消痈作用的靶点。