中枢神经系统(central nervous system，CNS)轴突损伤的修复是医学的重大课题之一。在以往的观念中成年哺乳动物的神经元和轴突没有再生能力，这是中枢神经轴突损伤难以修复的主要原因。轴突修复包括两个方面：轴突的再生和神经元的再生。随着许多可用于神经移植的细胞的发现和对成年动物中枢神经系统可塑性的再认识，细胞移植治疗CNS损伤和变性已经成为研究热点。多种细胞已经被用于基础研究和临床治疗中，其中最常用的神经元来源于未成熟的细胞及其前体，包括胚胎组织、细胞系和干细胞。目前，中枢神经系统具有可塑性作为基本的理论已经被广泛接受，新的观念认为不但神经元和它们的突起可以重新排列，并且在一生中都可以产生新的神经元加入神经网络。这就使得一种设想成为可能：植入的神经元加入到宿主神经元形成的神经网络中，修复由于神经变性和损伤导致的神经功能的缺陷。虽然已有很多研究着眼于移植神经元的长期存活和分化，但少有研究关注移植的由前体细胞改变表型得到的神经元样细胞在宿主中的成熟程度以及它们能否和宿主神经元形成功能性连接，特别是突触连接。PC12未成熟的神经元细胞系，它可以在神经生长因子(NGF等)的作用下诱导分化为神经元样细胞，形成神经突起和突触样连接，被广泛用于研究神经营养因子的作用和神经元分化。以往研究表明PC12细胞在宿主脑内可以存活12个月以上，但PC12细胞在宿主体内的具体分化情况还不清楚，即它们能否在宿主环境下诱导分化为神经元样细胞并与宿主神经元之间形成突触连接。为此，我们建立了体外原代神经元和诱导的PC12 博士学位论文3 细胞体外共培养模型，在此模型中诱导 PC细胞分化为神经元 并长出神经突起，而且能与原代神经元形成突触连接。 第一部分原代神经元分离及与转染绿色荧光蛋白的PC12 细胞共培养模型建立皮层原代神经元的分离培养：取新生 12 ，J’时以内的 WIStal大鼠，分离皮层，胰蛋白酶消化后进行有血清培养；4－5天后，加入阿糖胞昔杀死分裂细胞，继续培养10天左右接种细胞，经6－12小时细胞贴壁，呈圆形或者椭圆形，细胞周围有明显的光晕。2－3天后，细胞明显增大，突起数增多且不断伸长。加入阿糖胞昔杀死分裂细胞，漂浮起来形成细胞团。然后除去阿糖胞昔，继续培养10天左右，镜下神经元的细胞核和核仁清晰可见，神经突起多而粗大，网络稠密。稳定表达绿色荧光蛋白的PC12细胞的制备：大鼠的嗜铬细胞瘤细胞来源的未成熟的细胞系（PC12 cell）ffi含 10％马血清和5％胎牛血清的 DMEM饲养，将增强绿色荧光蛋白的质粒 DNA（EGFP－Nvectof）转染到 PC12细胞中，经 G418筛选获得稳定表达EGFP的细胞。转染4周后，可得到近100o表达EGFP的PC12细胞亚克隆。共培养模型的建立：收获上述获得稳定转染的 PC细胞，细胞悬液按照 IX10‘pC12／每皿的密度植入原代神经元的培养皿，用包含2％马血清的＊＊＊M饲养，4天后加入阿糖胞昔去除未分化细胞。 第二部分：NGF诱导的PC12细胞分化及与原代神经元 之间的突触形成 NGF诱导的PC12细胞分化：PC12种植到原代神经元后将NGF（25 ＂g／ml）加入培养液，PC随即长出神经突起，突起的长度和数量 均不断增长，PC细胞分化为神经元样细胞。 博士学位论文4FMIJ3荧光造影：高钾离子的去极化刺激30 mM external K＋，60s，Klebs－ingCr buffer）使突触末端囊泡被 FM143＊0 pM）染色，细胞固定后在共聚焦激光扫描显微镜下观察，电子图像显示出活性的突触末端。可以发现 PC细胞分化来的神经元与周围的原代神经元形成功能性突触，显示为FM143亮点。免疫电镜：细胞经4％多聚甲醛和0刀5％戊二醛固定，酒精梯度脱水后包埋于 Epon slZ（含 DMP）中，然后用偶联 IgG的、直径10 urn的胶体金颗粒对 GFP进行兔疫标记。电镜下可见带有金颗粒并包含嗜铬颗粒的 PC细胞和原代神经元的突起之间，以及原代神经元胞体和 PC细胞伸出的神经突起之间形成突触连接，突触的各个结构清晰可见。 结论：移植神经元细胞能否和宿主神经元建立突触连接是移植治疗的基本问题。本实验结果显示在体外神经前体细胞乃 PC细胞）在诱导分化剂（如 NGF）作用下改变表型形成的神经元样细胞可以和原代神经元建立突触连接，这证明细胞移植治疗修复轴突损伤等中枢神经系统疾病是可能的，并为研究移植细胞与宿主之间 的相互联系和作用提供一个简单、有效的平台。