研究背景与目的Galectin-4(Gal-4)是串联复合型半乳糖凝集素,拥有两个相似的糖识别域(carbohydrate cognition domain,CRD)。Gal-4参与调节细胞增殖、迁移并且可以介导细胞粘附,在细胞内以及循环中均有表达。目前已经在很多癌症中检测到Gal-4的表达,如结直肠癌、肝细胞癌、乳腺癌、胃癌等,但是关于Gal-4在癌症进展中的研究十分有限,仅有报道明确了 Gal-4在结直肠癌中可以促进肿瘤细胞的增殖和迁移。在肺腺癌中,仅有文献证明Gal-4的高水平表达是转移的独立预测因子,与临床不良预后有关。本课题组的前期工作中首次研究了 Gal-4在肺腺癌转移中的作用,结果发现Gal-4在A549和H1299这两种高表达Gal-4的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞的侵袭转移过程中发挥了相反的调控作用,但是具体调控两种细胞间相反作用的机制尚不明确。本论文旨在通过增加非小细胞肺癌的种类进一步确证Gal-4对不同非小细胞肺癌侵袭转移的调控作用,并深入探讨详细的调控机制,对于揭示Gal-4在NSCLC转移中的作用和机制,能否作为不同肺腺癌独立的预测因子以及药物治疗靶点提供理论和实验依据。实验方法和结果实验方法:1.检测细胞内Gal-4对H460和Calu-1细胞粘附、侵袭和迁移能力的影响论文中以高表达Gal-4的NSCLC细胞H460和相对低表达Gal-4的NSCLC细胞Calu-1作为研究对象,首先采用siRNA技术干扰H460细胞和Calu-1细胞内Gal-4的表达,同时采用质粒转染技术升高Calu-1细胞内Gal-4的表达,采用Western blot方法检测两种细胞内Gal-4的表达情况。接下来,采用划痕实验、粘附实验和Transwell实验检测干扰或过表达细胞内Gal-4后H460细胞和Calu-1细胞的粘附、侵袭、转移能力的变化。2.检测细胞内Gal-4对H460和Calu-1细胞的粘附、侵袭和迁移产生不同作用的机制首先,采用粘附实验和Transwell实验确定粘附分子N-cadherin、CD44和E-cadherin参与调控H460和Calu-1细胞的侵袭和粘附的作用。进一步在蛋白水平检测干扰Gal-4后两种粘附分子N-cadherin、CD44和E-cadherin在细胞中的蛋白表达变化。接下来为进一步探讨Gal-4调控粘附分子N-cadherin、CD44和E-cadherin蛋白表达的机制,我们检测了 Gal-4对转录调控因子NF-κB,p-STAT3,β-catenin表达的影响。通过加入NF-1κB抑制剂PDTC和p-STAT3抑制剂HO-3867,检测粘附分子表达水平的改变来确定这两种转录调控因子有无上下游关系。通过干扰或过表达NSCLC细胞内Gal-4后,观察加入NF-κB抑制剂PDTC或β-catenin抑制剂ICG-001对细胞迁移、侵袭和粘附能力的影响,确定Gal-4在调控NSCLC细胞侵袭转移以及与血管内皮细胞粘附过程中是否与NF-κB和β-catenin相互作用来调控下游粘附分子的作用机制。3.检测细胞内Gal-4对不同NSCLCs细胞侵袭和转移的相反调控作用与细胞内E-cadherin表达水平的相关性采用Western blot法和PCR法分别检测在A549、H1299、Calu-1以及H460四种细胞中E-cadherin的蛋白和基因表达水平。干扰细胞内Gal-4后,通过免疫共沉淀实验提取E-cadherin/β-catenin复合物,检测Gal-4对复合物的形成以及细胞内β-catenin表达的影响。4.检测细胞内Gal-4对不同NSCLCs细胞转移的相反调控作用与细胞内抑癌基因p53表达水平的相关性采用Western blot法和PCR法分别检测在A549、H1299、Calu-1以及H460四种细胞中p53的蛋白和基因表达水平。通过划痕实验检测p53抑制剂pifithrin-β对四种NSCLC细胞(A549、H1299、Calu-1和H460)迁移的影响,通过Western blot方法检测p53对相关粘附分子的影响。采用p53抑制剂pifithrin-β在干扰或过表达细胞内Gal-4后,通过划痕实验验证p53在Gal-4调控不同NSCLC细胞转移中的作用。5.检测细胞内Gal-4对NSCLCs细胞侵袭转移的相反调控作用与细胞内原癌基因Ras表达水平的相关性通过划痕实验检测:Ras抑制剂salirasib是否影响四种NSCLC细胞(A549、H1299、Calu-1和H460)的迁移能力。干扰或过表达细胞内Gal-4后再加入Ras抑制剂salirasib,通过划痕实验、粘附实验和Transwell侵袭实验观察Ras在Gal-4调控不同NSCLC细胞迁移、粘附和侵袭中的作用。6.检测细胞内Gal-4对裸鼠体内A549和H1299细胞肺转移的影响体内实验选取了具有代表性的高表达Gal-4的NSCLC细胞A549细胞和H1299细胞作为观察对象,且由体外实验结果可知,Gal-4对这两种细胞体外的侵袭转移有着相反的作用。免疫缺陷裸小鼠尾静脉注射生物发光标记的肺癌A549-Luc细胞和H1299细胞,且每种细胞均设置对照组和siGal-4组(细胞处理方法同体外),注射A549-Luc细胞的小鼠利用小动物活体成像仪的生物发光拍照,每隔十天拍照一次,观察小鼠的肺部肿瘤转移情况;注射H1299细胞的小鼠由前期预实验结果确定了肺转移成瘤时间,待小鼠肺部转移明显时,剖取小鼠肺脏,拍照观察不同处理组小鼠的肺部肿瘤转移情况。实验结果:1.细胞内Gal-4抑制H460细胞粘附、侵袭和迁移,促进Calu-1细胞粘附、侵袭和迁移Western blot结果显示,干扰Gal-4能降低H460细胞和Calu-1细胞内Gal-4的蛋白表达,而过表达Gal-4能升高Calu-1细胞内Gal-4的蛋白表达。划痕实验、粘附实验和Transwell实验结果表明干扰细胞内Gal-4后,H460细胞的粘附、侵袭和迁移与对照组相比明显升高,而Calu-1细胞的粘附、侵袭和迁移与对照组相比明显降低。过表达Calu-1细胞中的Gal-4后,划痕实验、侵袭实验和粘附实验结果表明,过表达组的粘附、侵袭和迁移与对照组相比明显升高。这说明细胞内Gal-4抑制H460细胞的侵袭转移,促进Calu-1细胞的侵袭转移。2.细胞内Gal-4调控粘附分子N-cadherin和CD44的表达来调节H460和Calu-1细胞侵袭转移采用siRNA技术分别干扰H460和Calu-1细胞的N-cadherin和CD44后,发现两种细胞的粘附和侵袭能力明显下降,这说明粘附分子N-cadherin和CD44可促进H460和Calu-1细胞的粘附和侵袭过程。干扰H460和Calu-1细胞的Gal-4后,用Western blot方法检测蛋白表达发现H460细胞的N-cadherin和CD44表达均上调;Calu-1细胞的N-cadherin和CD44表达均下调。说明细胞内Gal-4通过调控粘附分子N-cadherin和CD44的表达来调节H460和Calu-1细胞的粘附和侵袭。3.细胞内Gal-4调控转录因子p-STAT3/NF-κB的表达水平来调节下游粘附分子的表达干扰H460和Calu-1细胞的Gal-4后,检测细胞内转录因子p-STAT3和NF-1κB的表达,结果发现H460细胞干扰组的p-STAT3和NF-κB上调,Calu-1细胞干扰组的p-STAT3和NF-κB下调。加入NF-κB抑制剂PDTC或p-STAT3抑制剂HO-3867后,再来检测细胞内p-STAT3和NF-κB的表达水平,发现加入p-STAT3抑制剂HO-3 867后两种细胞内NF-κB水平下调,而加入PDTC后两种细胞内p-STAT3的水平无变化,说明p-STAT3位于NF-κB的上游。加入NF-κB抑制剂PDTC后,采用划痕实验检测两种细胞的迁移能力,结果发现NF-κB可促进H460和Calu-1细胞的迁移,蛋白检测结果表明NF-κB 可调控下游粘附分子N-cadherin,E-cadherin和CD44的表达以及MMP-2的表达水平。干扰两种细胞的Gal-4后,再加入NF-κB抑制剂PDTC后,通过划痕、侵袭以及粘附实验检测发现,与Gal-4干扰组相比,加入NF-κB抑制剂PDTC的Gal-4干扰组的侵袭转移以及与血管内皮细胞的粘附功能下降,同时蛋白检测结果说明Gal-4通过调节转录因子p-STAT3/NF-κB调控下游粘附分子N-cadherin、CD44以及MMP-2的表达来影响细胞的粘附、侵袭和转移。4.细胞内Gal-4调控转录因子β-catenin的表达水平来调节下游粘附分子表达干扰H460和Calu-1细胞的Gal-4后,检测细胞内转录因子|p-catenin的表达,结果发现H460细胞干扰组的β-catenin上调,Calu-1细胞干扰组的β-catenin下调。加入β-catenin抑制剂ICG-001后,采用划痕实验发现,加入β-catenin抑制剂ICG-001可以抑制H460和Calu-1细胞的迁移,同时蛋白结果表明β-catenin可以促进下游粘附分子N-cadherin和CD44以及MMP-2的表达。干扰两种细胞的Gal-4后,再加入β-catenin抑制剂ICG-001,通过划痕、侵袭以及粘附实验检测发现,与Gal-4干扰组相比,加入β-catenin抑制剂ICG-001的Gal-4干扰组的侵袭、转移以及与血管内皮细胞的粘附功能下降,结合蛋白检测结果说明Gal-4通过调节转录因子β-catenin调控下游粘附分子E-cadherin、N-cadherin和CD44以及MMP-2的表达来影响细胞的粘附、侵袭和转移。5.细胞内Gal-4促进A549和H460细胞内E-cadherin/β-catenin复合物的形成PCR和Western blot检测结果显示,E-cadherin在A549、H460细胞中高表达,而在H1299细胞中不表达,在Calu-1细胞中几乎不表达。干扰这四种细胞内的Gal-4后,通过免疫共沉淀实验分离出细胞内的E-cadherin/β-catenin复合物,Western blot结果表明,Gal-4在A549和H460细胞中上调E-cadherin/β-catenin复合物的蛋白表达水平,而在H1299和Calu-1细胞中未检测到明显的E-cadherin的表达,这表明Gal-4促进A549和H460细胞中E-cadherin/β-catenin复合物的形成从而抑制两种细胞的转移。6.p53通过下调N-cadherin、CD44和MMP-2的表达抑制A549和H460细胞的迁移PCR和Western blot检测结果显示,在A549和H460细胞中均有p53的表达,而在H1299细胞中几乎未见p53的基因表达,在Calu-1细胞中存在少量的p53表达。划痕检测结果显示,在加入p53抑制剂pifithrin-β后,A549和H460细胞的迁移率上升,说明p53可抑制A549和H460细胞的迁移。同时蛋白检测结果显示,在加入p53抑制剂pifithrin-β后,A549和H460细胞的N-cadherin、CD44和MMP-2表达升高,结果表明p53通过下调粘附分子N-cadherin和CD44的蛋白表达水平抑制A549和H460细胞的迁移。7.细胞内Gal-4不直接调节p53的表达来抑制A549和H460细胞的迁移在干扰细胞中的Gal-4后加入p53抑制剂pifithrin-β,观察到Gal-4对A549和H460细胞迁移的影响未见明显变化,表明Gal-4并不直接通过调节p53水平来抑制两种细胞的迁移。8.Ras促进4种NSCLCs细胞的迁移向A549、H1299、Calu-1和H460四种细胞中加入Ras抑制剂salirasib后,划痕实验结果发现加入了Ras抑制剂salirasib的细胞组与对照组相比细胞迁移率均下降,且随着salirasib浓度的增加,对细胞迁移的抑制作用越明显,说明在A549、H1299、Calu-1和H460四种细胞中,Ras可以促进4种NSCLCs细胞的迁移。9.细胞内Gal-4调节Ras表达来促进H1299和Calu细胞迁移、粘附和侵袭,抑制A549和H460细胞迁移、粘附和侵袭干扰A549、H1299、Calu-1和H460四种细胞中的Gal-4后,再加入Ras抑制剂salirasib后,发现在A549和H460细胞中,干扰Gal-4促进细胞迁移、侵袭和粘附作用均被明显抑制。而在H1299和Calu-1细胞中,干扰Gal-4抑制细胞迁移、侵袭和粘附作用也被明显抑制。上述结果说明细胞内Gal-4是通过调节Ras表达来促进H1299和Calu-1细胞迁移、粘附和侵袭,抑制A549和H460细胞迁移、粘附和侵袭。同时过表达Calu-1细胞内的Gal-4后,再加入Ras抑制剂salirasib,过表达Gal-4促进Calu-1细胞迁移、侵袭以及黏附的作用同样被明显抑制,结果进一步证明细胞内Gal-4通过调节Ras表达来促进H1299和Calu-1细胞迁移、粘附和侵袭,抑制A549和H460细胞迁移、粘附和侵袭。10.干扰A549细胞内Gal-4表达可增加裸鼠A549细胞肺转移,而干扰H1299细胞内Gal-4表达可减少裸鼠H1299细胞肺转移体内实验结果发现,干扰Gal-4后的A549-Luc细胞相比于未干扰Gal-4的A549-Luc对照组,生物发光强度在小鼠肺部有了明显增加,解剖小鼠肺部后同样发现肺转移结节数明显增多,说明干扰A549细胞内Gal-4后可促进A549细胞肺转移,该结果与体外实验结果一致。而尾静脉注射了干扰Gal-4的H1299细胞后,与未干扰Gal-4的对照组相比,小鼠肺部转移结节数明显减少。以上结果说明干扰A549细胞内Gal-4表达可增加裸鼠A549细胞肺转移,干扰H1299细胞内Gal-4表达可减少裸鼠H1299细胞肺转移。实验结论1.细胞内Gal-4抑制H460细胞粘附、侵袭和迁移,促进Calu-1细胞粘附、侵袭和迁移。结合本课题组前期实验结果,初步确证细胞内Gal-4分别对A549和H460细胞,以及H1299和Calu-1细胞的侵袭转移的影响具有相似性。细胞内Gal-4调控粘附分子N-cadherin和CD44的表达来调节H460和Calu-1细胞侵袭转移,在H460细胞中,细胞内Gal-4抑制转录因子p-STAT3/NF-κB和β-catenin的表达水平来减少下游粘附分子表达;在Calu-1细胞中,细胞内Gal-4促进转录因子p-STAT3/NF-κB和β-catenin的表达水平来增加下游粘附分子表达。其中,Gal-4对β-catenin的调控作用更显著。2.Gal-4在A549和H460细胞中可促进E-cadherin/β-catenin复合物的形成,而减少了与Gal-4相互作用的β-catenin的水平,因此在A549和H460细胞中Gal-4表现出抑制NSCLC细胞的侵袭转移;而在另外两种细胞中由于不表达或很低水平E-cadherin的表达,故没有E-cadherin/β-catenin复合物的形成,因此Gal-4可直接促进肿瘤细胞中β-catenin入核发挥作用从而表现出促进H1299和Calu-1细胞侵袭转移的作用。3.在A549和H460细胞中有p53的表达,而在H1299和Calu-1细胞中没有p53的表达,研究发现p53通过下调N-cadherin、CD44和MMP-2的表达来抑制A549和H460细胞的迁移,但我们同样发现Gal-4不直接通过p53介导影响NSCLC细胞的侵袭转移。4.Ras可以促进4种NSCLCs细胞的迁移。细胞内Gal-4可调节Ras表达来促进H1299和Calu-1细胞迁移,抑制A549和H460细胞迁移。体内实验进一步验证了Gal-4抑制A549细胞转移,促进H1299细胞转移的作用,与体外细胞实验结论一致。