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肝癌是世界上最常见也是致死率最高的癌症类型之一,而现有的靶向治疗手段对其疗效甚微。肌细胞增强因子（myocyte enhancer factor 2,MEF2）作为一个被广泛研究的转录因子家族,其参与并调控肌肉和神经发育过程。值得一提的是,该家族成员中,MEF2D的蛋白结构特异性以及在肿瘤中的作用逐渐被人们关注。MEF2D作为转录因子,其蛋白结构的N端包含一个MADS/MEF2结构域,介导MEF2D自身的二聚化、MEF2D与DNA的结合以及与其他蛋白的相互作用,该结构域在MEF2家族各成员中具有保守性。而MEF2D蛋白的C端则包含多个转录激活结构域,且与MEF2家族其他成员有明显差异。MEF2D在以肝癌为主的多种肿瘤中高表达,并提示疾病的进展和不良预后。具体作用上,MEF2D可以促进肿瘤的生长、侵袭转移和血管化等过程,不仅调控肿瘤细胞自身生物学行为,也影响整个肿瘤微环境。由于炎症相关的发病机制,很多肝癌都具有免疫原性,反映为其微环境中有各种类型的免疫细胞浸润。其中一些免疫细胞,如效应性T细胞介导的抗肿瘤免疫反应可以抑制肝癌的进程。相反,肝癌也利用各种机制进行免疫逃逸。尽管有前期研究关注肝癌细胞MEF2D与肿瘤微环境的相互作用,但是研究中所采用的实验方法,例如体外细胞培养体系或免疫缺陷鼠移植瘤模型,并没有将免疫细胞纳入观察和考虑。此外,MEF2D蛋白的乙酰化修饰可以显著增强其DNA结合能力进而促进其下游多种靶基因的转录激活。包括乙酰基转移酶p300和去乙酰化酶HDAC3在内的多种酶可以调控MEF2D乙酰化。上述研究现状表明,MEF2D及其乙酰化调控机制在肝癌免疫微环境中的作用及定位有待明确。目前,阻断免疫检查点细胞程序性死亡受体1（programmed cell death 1,PD-1）及其配体PD-L1相互作用的免疫疗法在多种肿瘤治疗中被应用,并且展现出令人满意的疗效。但是大多数肝癌患者对该疗法不敏感。前期研究发现PD-1/PD-L1阻断疗法的疗效可能与肿瘤细胞表达PD-L1的水平有关。随后越来越多的证据表明,原本在肝癌细胞中沉默的PD-L1在多种因素的刺激下被激活表达,并促进肝癌免疫逃逸,这些因素包括干扰素γ（interferon gamma,IFNG）,细胞周期相关激酶抑制剂,乙型肝炎病毒以及癌基因MYC等。因此,明确肝癌细胞PD-L1表达的调控机制或上游信号通路,可能为提高靶向PD-L1/PD-1疗法的疗效提供理论和实验基础。PD-L1的表达调控涉及多种机制:细胞内PD-L1蛋白水平会受到蛋白转运机制和蛋白翻译后修饰机制的调控,也会受到基因转录和RNA稳定性调控机制的影响。肿瘤浸润的免疫细胞分泌的IFNG也可以诱导PD-L1表达:肿瘤细胞中IFNG信号通路被激活会显著上调IFN调节因子的表达,进而激活PD-L1基因CD274的转录。但无论是PD-L1的哪种调控机制,在肝癌中都尚未完全阐明。基于上述研究现状,我们试图通过这项研究明确MEF2D能否调控PD-L1等关键效应分子并影响肝癌的免疫逃逸过程,以期为肝癌的临床治疗提供新的策略。本研究的实验设计和结果如下:实验设计:利用流式细胞术分析20例新鲜肝癌组织中MEF2D的表达和免疫细胞浸润及活化情况。利用免疫组化技术观察和分析225例肝癌标本中MEF2D的表达,免疫细胞的浸润情况以及和预后相关性。构建MEF2D肝脏条件性敲除小鼠(MEF2DLPC-KO mice)并在SMMC-7721,Huh7,H22和Hepa1-6等多种人源和鼠源肝癌细胞系中敲除或敲低MEF2D,p300和/或sirtuin 7（SIRT7）等基因的表达,利用RNA测序,Western blot,双荧光素酶报告基因系统以及染色质免疫共沉淀技术在上述组织和细胞中分析基因的表达及调控机制。利用蛋白质免疫共沉淀技术和pull-down实验检测MEF2D乙酰化水平和蛋白之间的相互作用。构建同源野生型小鼠肝脏原位移植瘤模型,系统给予抗体阻断体内T细胞功能或系统给予PD-1单抗治疗,评估移植瘤生长情况和小鼠生存情况,免疫组化和流式细胞术检测瘤内浸润免疫细胞的数量和活化程度。本研究主要的实验结果如下:1.在临床肝癌表本中,我们发现MEF2D的表达与CD4+和CD8+T细胞浸润数量呈负相关,与PD-1阳性或TIM3阳性的CD8+T细胞数量呈现正相关。在H22细胞中敲除MEF2D显著抑制对应移植瘤在同源野生型小鼠,而非免疫缺陷小鼠或抗体抑制CD8+T细胞功能的小鼠体内的生长。同源野生型小鼠体内MEF2D缺失的移植瘤相比对照组,其瘤内浸润的T细胞数量和活化程度增加。2.敲除MEF2D导致肝癌细胞中PD-L1的表达降低。MEF2D可以直接与编码PD-L1蛋白的CD274基因启动子结合并激活基因转录。肝癌细胞中过表达乙酰基转移酶p300或敲除去乙酰化酶SIRT7,可以促进MEF2D的乙酰化进而增强其DNA结合能力和结合位点的组蛋白乙酰化,最终促进CD274基因转录。IFNG可以诱导肝癌细胞表达p300并促进其结合MEF2D,并抑制SIRT7和MEF2D的直接结合。IFNG通过MEF2D影响PD-L1的机制与已知的IRF1/9-PD-L1通路在肝癌细胞中相互独立发挥作用。当没有IFNG刺激肝癌细胞时,SIRT7和MEF2D持续结合并削弱MEF2D乙酰化和PD-L1的表达。3.敲除SIRT7显著抑制肝癌细胞自身增殖和免疫缺陷鼠中移植瘤的生长。但相比对照组,同源野生型小鼠中SIRT7缺失的移植瘤PD-L1表达增加,T细胞的浸润和活化程度降低。在此基础上使用PD-1单抗治疗可以明显抑制移植瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存时间。本研究主要的结论如下:1.敲除MEF2D可以通过促进CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫过程抑制肝癌的进展。2.在IFNG的作用下,MEF2D通过直接转录激活CD274基因,增强免疫检查点分子PD-L1的表达进而削弱T细胞介导的抗肿瘤免疫过程。3.乙酰基转移酶p300介导的MEF2D乙酰化过程在IFNG诱导肝癌细胞PD-L1表达的过程中发挥重要作用。4.在缺乏IFNG的情况下,去乙酰化酶SIRT7能直接结合并抑制MEF2D乙酰化,进而抑制肝癌细胞PD-L1的表达。5.SIRT7缺失导致的肝癌细胞免疫逃逸依赖MEF2D-PD-L1通路。6.抑制SIRT7联合PD-1单抗显著抑制肝癌的进展。综上所述,本研究发现肝癌细胞中MEF2D可以促进PD-L1的表达,并进一步抑制CD8+T介导的抗肿瘤免疫反应。当IFNG刺激肝癌细胞时,p300促进MEF2D乙酰化过程,进而促进MEF2D与CD274基因启动子区域结合并上调PD-L1表达。当没有IFNG刺激肝癌细胞时,SIRT7抑制MEF2D乙酰化和PD-L1的表达。由于SIRT7显著促进肝癌细胞自身增殖。因此,相比单一免疫检查点抑制剂,我们提出干预SIRT7联合PD-1/PD-L1单抗可能是更为有效的肝癌治疗策略。