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中药产品是中医药产业链发展的重要物质基础。中药产品制剂成型需要经过一系列加工炮制、提取制备工艺。这一系列生产工艺使得产品原料形态学性状缺失,部分化学成分变化,并引起严重的DNA降解,因此,传统的形态学、普通的化学及分子鉴定方法处理中药产品原料的鉴定问题,有时难以奏效。由于缺乏有效的鉴定手段,中药产品中原料掺假问题十分严重,阻碍了中药产业进一步发展,因此急需一种新型方法完善中药产品原料的鉴定体系。 本课题组基于Mini-barcoding技术,首次提出了中药材分子身份证这一概念。中药材分子身份证指一段极短的(20-50bp)物种特异性DNA序列。基于中药材分子身份证建立的分子鉴定方法缩短了目标序列扩增长度,极大提高了鉴定效率,可以实现目标药材的快速准确鉴定。本研究具体内容及方法如下: (1)基于目标药材基源物种的DNA条形码序列,建立分子身份证序列筛选数据库,通过比对分析,基于SNP位点,寻找物种特异性短序列。 (2)改良DNA提取方法,提取中药产品的总DNA。设计特异性引物,利用PCR或恒温扩增技术(RPA)扩增含有分子身份证的短序列。 (3)利用琼脂糖凝胶电泳、测序、试纸条等下游检测手段,对序列扩增产物进行检测,得到鉴定结果。 本研究建立了西洋参、冬虫夏草和银杏叶的分子身份证序列,实现了蒸煮物、中成药、保健品等产品中上述药材的鉴定检测。通过对西洋参、冬虫夏草蒸煮材料的实验结果可知,经处理的中药原料中的确存在严重的DNA降解,利用分子身份证技术扩增短片段,可有效缓解传统条形码技术在DNA降解严重材料中的不足。通过对人参类中成药及含有银杏叶类保健品的鉴定研究中发现,中药产品的混伪率较高,其中在24个批次的人参类中成药中,5份被西洋参替代,2份检测掺杂有西洋参;在28份银杏叶提取物中,9份检测出掺杂槐米。分别设计了冬虫夏草常见混淆品的特异引物,通过PCR方法即可检测冬虫夏草样品中是否含有混淆品。 本研究建立了西洋参、冬虫夏草、银杏叶和槐米的分子身份证序列,结合不同扩增技术和下游检测手段,实现了中药产品原料的快速准确鉴定。经验证,分子身份证技术可发展为一种快速现场检测鉴定技术,高效鉴定中药产品中的关键及混伪原料,进而完善中药产品的监管机制。