目的:冠状动脉粥样硬化心脏病是世界范围内患病率和致死率最高的疾病之一,为我国居民疾病死亡构成的首位。血小板功能亢进或异常激活引起的血管内血栓形成是此类疾病的病理基础。冠状动脉粥样硬化斑块的破裂或表面损伤,引起循环血液中的血小板在受损血管内膜下的黏附及聚集,始动冠状动脉血栓的形成。针对血栓形成的始动环节——血小板黏附、聚集,目前抗血小板聚集药物已成为治疗动脉血栓性疾病的最主要治疗手段。目前临床上比较成功的抗血小板聚集药物主要有环氧化酶抑制剂阿司匹林、P2Y12受体拮抗剂氯吡格雷、磷酸二酯酶(PDE)抑制剂西洛他唑和膜糖蛋白受体GPⅡb/Ⅲa拮抗剂阿昔单抗等。尽管目前的抗血小板药物在冠心病等动脉血栓性疾病治疗方面疗效显著,但同时出现出血、药物抵抗等不良反应影响着临床治疗。近年来,许多中药复方、有效成分及单体已被证实具有良好的抗血小板、抗血栓作用。利用传统中药多途径多靶点抗血小板聚集的优势,开发新型、安全有效的抗血小板药物用于防治冠心病等动脉血栓性疾病具有重要实践意义。化橘红为芸香科植物化州柚或柚的未成熟或近成熟的干燥外层果皮,为传统中医常用的理气化痰的要药,目前在临床上被广泛用于呼吸系统、消化系统和心血管系统疾病。化橘红富含黄酮类成分,其中,柚皮素属于二氢黄酮类化合物,是化橘红的主要有效成分,也是其“化痰”作用的有效成分之一。现代药理研究证明,柚皮素具有抗炎症、抗氧化、降血脂、抗心律失常及抗动脉粥样硬化等多种药理活性,在防治心血管疾病方面越来越受到重视,可被开发应用于医药、食品等领域。目前,有关柚皮素对血小板功能和血栓形成的影响尚未见详细报道。我们前期研究发现柚皮素能显著抑制二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集,但是其具体抗血小板作用机制尚不明确。因此,为了深入探讨柚皮素抗血小板的潜在机制,本课题以柚皮素对P2Y12受体信号途径的影响为切入点,研究柚皮素对血小板的功能、信号和动脉血栓形成的影响,以探讨柚皮素抗血小板的潜在靶点。方法:1.柚皮素抗血小板功能研究制备大鼠富血小板血浆(PRP)或洗涤血小板,采用血小板聚集仪观察柚皮素和柚皮苷对ADP诱导的PRP或洗涤血小板聚集的影响,同时观察柚皮素对不同刺激剂(ADP、胶原和凝血酶)诱导的洗涤血小板聚集的影响;采用乳酸脱氢酶(LDH)法检测柚皮素对血小板的毒性作用;采用流式细胞术检测不同浓度柚皮素对ADP刺激的血小板P-选择素表达和纤维蛋白原结合的影响,此外,使用Fluo3-AM负载血小板,采用流式细胞术检测柚皮素对ADP诱导的血小板内游离Ca2+水平的影响;采用荧光显微镜观察不同浓度柚皮素对血小板在固化纤维蛋白原上的扩展和在固化胶原上的黏附的影响;观察柚皮素对斑块回缩的影响。2.柚皮素抗血小板作用机制研究洗涤血小板孵育柚皮素后,给予ADP(10 μM)刺激血小板活化,裂解血小板,采用 Westem blot 技术检测柚皮素对 PI23Kp110β 蛋白表达,Akt(Ser473/Thr308)、ERK1/2(Thr202/Tyr204)和GSK3β(Ser9)的磷酸化表达,以及协同给予PI3K抑制剂后血小板Akt磷酸化表达的变化,并采用血小板聚集仪观察柚皮素协同给予PI3K抑制剂后对血小板聚集的影响;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测柚皮素对ADP(10 μM)诱导的血小板内cAMP和cGMP水平的影响,并进一步测定柚皮素对静息状态下血小板内cAMP、cGMP水平的影响;通过使用高效液相色谱法检测酶反应体系中剩余底物(cAMP或cGMP)的含量,进而反映柚皮素对血小板提取的磷酸二酯酶(PDE)活性的作用;采用Western blot检测柚皮素对ADP刺激的血小板内p>VASP(Ser157)、p-VASP(Ser239)蛋白水平,以及分别给予蛋白激酶A(PKA)抑制剂H89、蛋白激酶G(PKG)抑制剂Rp-8-Br-PET-cGMPS和蛋白激酶C(PKC)抑制剂GF109203X预先孵育血小板后,再用柚皮素处理,然后给予ADP刺激,观察抑制剂是否影响柚皮素对p-VASP(Ser239)蛋白水平的作用;采用血小板聚集仪进一步观察PKA抑制剂、PKG抑制剂预先孵育血小板后,再用柚皮素处理,是否影响柚皮素抑制ADP诱导血小板聚集的作用;另外,采用血小板聚集仪观察柚皮素与P2Y1、P2Y12受体拮抗剂合用对ADP诱导的血小板聚集的影响。3.柚皮素对整体动物血栓与凝血系统的作用研究SD大鼠分别给予柚皮素高(800 mg/kg)、中(400 mg/kg)、低(200 mg/kg)剂量和氯吡格雷(7.875 mg/kg)连续灌胃7 d后,制备PRP,采用血小板聚集仪测定柚皮素体内给药对ADP诱导的大鼠血小板聚集的影响;血小板聚集反应结束后,裂解血小板并提取蛋白,采用Western blot检测柚皮素对PI3Kp110β蛋白表达,Akt(Ser473/Thr308)和ERK1/2(Thr202/Tyr204)磷酸化表达的变化;建立FeC13诱导大鼠颈动脉血栓模型,采用超声血流仪检测柚皮素对颈动脉血流阻塞时间的影响,并剪取大鼠造模动脉进行H&E染色,观察血管组织形态学改变;采用小鼠断尾出血实验考察柚皮素对出血时间的影响;通过凝血四项考察柚皮素对大鼠凝血系统的影响。结果:1.柚皮素抗血小板功能研究①在PRP中,柚皮素(100 μM～800 μM)和柚皮苷(400 μM～800 μM)能显著抑制ADP(10 μM)的血小板聚集;在洗涤血小板中,柚皮素(100 μM～800μM 和柚皮苷(100μM～800μM)能显著抑制ADP(10μM)的血小板聚集;无论在PRP或者洗涤血小板中,柚皮素抑制ADP诱导的血小板聚集活性显著高于柚皮苷,此外,与在PRP抑制血小板聚集活性比较,柚皮音和柚皮素在洗涤血小板中抑制血小板聚集的活性显著提高;柚皮素能明显的抑制ADP(10μM)、凝血酶(0.2 U/mL)和胶原(2 μg/mL)诱导的洗涤血小板聚集,在相同浓度范围内(100 μM～800 μM),柚皮素对ADP引起的血小板聚集抑制作用效果最强。②柚皮素在100 μM～1600 μM的浓度范围内并不影响血小板膜的完整性,对血小板没有毒性作用。③柚皮素能明显抑制ADP刺激的血小板P-选择素表达。④柚皮素浓度在400μM～800μM的范围内可以明显抑制由ADP(10μM)诱导的血小板内Ca2+增加。⑤柚皮素(400 μ～800 μM)能显著抑制ADP诱导的纤维蛋白原结合,证明了柚皮素能抑制整合素αⅡbβ3介导的“由内-向外”信号。⑥柚皮素能显著抑制血小板在固化纤维蛋白原上的扩展,并能抑制血小板的斑块回缩,证明了柚皮素能抑制整合素αⅡbβ3介导的“由外-向内”信号。⑦柚皮素(200 μ～800 μM)能显著抑制血小板在固化胶原上的黏附。2.柚皮素抗血小板作用机制研究①柚皮素能明显的抑制ADP刺激的血小板内PI3Kpll0β蛋白表达、Akt(Ser473/Thr308)和 ERK1/2(Thr202/Tyr204)的磷酸化,但不影响 GSK3β(Ser9)磷酸化,同时,PI3K广谱抑制剂LY294002能增强柚皮素对Akt磷酸化及血小板聚集的抑制作用。②柚皮素(100～800 μM)剂量依赖性的抑制ADP诱导的血小板cGMP下降,而并不改变cAMP水平,此外,柚皮素浓度在400 μM～800 μM的范围内可以明显增加静息血小板内cGMP的水平,而并不影响血小板内cAMP的水平。③柚皮素(200μ～800 μM)在从大鼠血小板提取的PDE酶反应体系中,可显著升高酶底物cAMP或cGMP的剩余含量,证明柚皮素有抑制血小板内PDE酶活性的作用。④柚皮素(100μM～800 μM)可明显抑制由ADP诱导的p-VASP(Ser239)降低,但不影响p-VASP(Ser157)的蛋白水平,预先孵育PKG或PKC抑制剂并不影响柚皮素对p-VASP(Ser239)蛋白水平的作用,而预先孵育PKA抑制剂后,则能降低柚皮素对p-VASP(Ser239)蛋白水平的作用。⑤PKA抑制剂能逆转柚皮素介导的抑制ADP诱导的血小板聚集,而PKG抑制剂并不影响其作用。⑥P2Yi受体拮抗剂MRS2179、P2Y12受体拮抗剂MRS2395与柚皮素合用,均表现出协同抑制ADP诱导的血小板聚集的作用。3.柚皮素对整体动物血栓与凝血系统的作用研究①柚皮素体内给药能剂量依赖性的抑制ADP诱导的大鼠血小板聚集。②Western blot结果显示,柚皮素体内给药能显著抑制ADP刺激的血小板内Akt(Ser473/T3r308)和ERK1/2(Thr202/Tyr204)的磷酸化,但不影响PI3Kp110β的蛋白表达。③柚皮素(800 mg/kg)可以显著延长FeCl3诱导的大鼠颈总动脉血栓形成时间,血管病理切片显示柚皮素可以减轻血栓形成和血管内皮损伤。④柚皮素对小鼠断尾后的正常止血没有影响。⑤柚皮素不影响大鼠的凝血系统功能,相比之下,氯吡格雷能明显降低纤维蛋白原含量和延长凝血时间,表现出强大的抗凝作用。结论:柚皮素具有显著的抗血小板、抗动脉血栓作用,且没有明显的出血副作用,其抗血血小板作用机制为抑制PI3K通路和通过升高血小板内cGMP水平和PKA依赖的信号通路来介导VASP的磷酸化,推测P2Y12受体可能是柚皮素抗血小板活性作用的靶点。我们的研究为开发柚皮素作为一种新的安全有效的抗血小板药物提供了有价值的实验依据。