自噬是真核细胞内广泛存在的基本机制之一,它通过降解非必须蛋白以及功能障碍的细胞组分、满足细胞自身的代谢需求并实现细胞器的更新。已有研究表明自噬在线粒体清除以及细胞重编程方面发挥重要作用。而克隆胚恰恰由于其高发的线粒体功能障碍以及核不完全重编程而常常表现出发育异常、效率低下等诸多问题。因此,本研究通过观察猪克隆胚中供体线粒体和自噬随胚胎发育的分布变化,并分析调节自噬对供体线粒体分布以及一些与胚胎发育相关基因表达的影响,初步探索自噬在猪克隆胚早期发育过程中对供体线粒体的清除以及供体核重编程的可能作用。1典型依赖于LC3的自噬不参与猪克隆胚中供体线粒体的清除核移植前染色标记供体细胞线粒体,随后观察不同时期克隆胚中供体线粒体的分布变化。定义电激活完成的时间为Oh,结果显示克隆胚中的供体线粒体随胚胎发育而逐渐由核周附近散布于胞质(4 h)。在2细胞(28 h)以及4细胞(52 h)阶段,供体线粒体在不同卵裂球中存在不均等分布的现象。统计表明2细胞阶段以All(卵裂球中都有)、Half(部分有)、No(都没有)三种形式存在供体线粒体的胚胎的比例分别为51.22%、26.83%以及21.95%。而在某些克隆囊胚(148 h)中仍可观察到少量供体线粒体的存在。与此同时自噬标志蛋白LC3的荧光染色结果表明,克隆胚中的自噬出现于4 h并绕核分布。电镜观察显示该时期的克隆胚比孤雌胚展现出更多的双膜自噬泡以及异常形态的线粒体。荧光强度分析的结果显示,2细胞克隆胚中LC3荧光最强,4细胞显著降低(P<0.05),而孤雌胚中最强的LC3荧光则出现在4细胞阶段。Western blot结果也表明2细胞克隆胚中LC3-II/LC3-I>1细胞(4 h)克隆胚>1细胞(4h)孤雌胚。尽管可以观察到LC3与溶酶体染料间的共定位(4 h,28 h),但在各时期胚胎中均没有观察到LC3与供体线粒体信号间的重叠。同时电镜样本中也没有看到典型线粒体自噬的结构。而在化学激活过程中添加3-MA抑制自噬,2细胞阶段(28 h)含有供体线粒体的重构胚比例也未发生明显变化。2胞质排出现象的观察及其对供体线粒体清除特异性的初探染色观察时偶然发现～87.93%的2细胞克隆胚的两个卵裂球之间有部分胞质排出,并且在某些胚胎排出的胞质中可以观察到供体线粒体的存在。尽管微丝抑制剂CB(细胞松弛素B)处理可以抑制胞质分裂和排出,但携带供体线粒体的胚胎比例并没有明显改变。另外,孤雌胚中同样存在胞质排出的现象,并且在这部分排出的胞质中也能观察到母源线粒体的存在。因此初步的实验表明这种排出对于克隆胚中供体线粒体的清除不具有特异性。3自噬参与母源mRNA的降解以及对表观修饰的调节qRT-PCR检测2细胞以及4细胞克隆胚和孤雌胚中与自噬和重编程相关的部分基因表达情况。结果显示与同时期的孤雌胚相比,2细胞克隆胚中母源Bmp15、Hlfoo以及Dppa3的表达水平更高(P<0.05或P<0.01),4细胞时LC3、Sox2以及胚胎基因组活化的标志基因eIF1A则更低(P<0.05)。当2细胞克隆胚中LC3被siRNA成功敲减后(P<0.01),母源 基因 Cyclin B、Bmp15、Gdf9、c-mos、H1foo 以及 Dppa3的表达显著增加,同时DNA甲基转移酶Dnmt1、Dnmt3b以及转录因子StSt3的表达也被明显影响(P<0.05)。而当4细胞阶段克隆胚中的自噬被诱导时,eIF1A和Stat3的表达显著升高(P<0.05)。综上所述,本研究发现克隆胚中供体线粒体在早期分裂期间存在不均等分布以及随胞质排出的现象,但这种排出不是供体线粒体清除的特异性机制。而经典的LC3依赖型自噬主要发生在克隆胚2细胞阶段,尽管不直接参与供体线粒体的清除,但它可以通过参与母源mRNA的降解以及调节DNA甲基转移酶的表达而影响胚胎基因组活化。我们的结果将有助于进一步了解克隆胚中供体线粒体的存在状态,并为探究自噬在猪克隆胚早期发育过程中的精确作用、理解早期胚胎发育机理以及改善克隆胚较低的成功率提供参考。